中国番茄黄曲叶病毒抵御RNA沉默的机制和番茄黄曲叶病毒的分子变异研究

摘要

双生病毒是世界范围内广泛发生的一类单链环状DNA病毒,已在多个国家和地区的作物上造成毁灭性灾害。为了更好地了解双生病毒的致病机理及病毒的危害流行,本论文围绕双生病毒抵御RNA沉默的机制以及双生病毒的分子变异开展了以下研究:
　　 1中国番茄黄曲叶病毒及其伴随的卫星DNA来源的小干扰RNA的鉴定
　　 利用Solexa高通量测序技术测定了中国番茄黄曲叶病毒(TYLCCNV)及其伴随的卫星betasatellite(TYLCCNB)来源的小RNA(Small RNA,sRNA)(V-sRNA和S-sRNA)的产生情况。在侵染的番茄和本氏烟中,既能检测到正义链来源的V-sRNA和S-sRNA,又能检测到负义链来源的V-sRNA和S-sRNA,而且V-sRNA和S-sRNA的大小以22-nt、21-nt和24-nt为主.将V-sRNA和S-sRNA匹配到TYLCCNV和TYLCCNB的基因组上发现V-sRNA和S-sRNA的分布是不均匀的,在TYLCCNV单独侵染的番茄和本氏烟以及TYLCCNV和TYLCCNB突变体共同接种的本氏烟中,AV2和AVl的5’末端是V-sRNA产生的热点区,而在TYLCCNV和TYLCCNB共同侵染的番茄和本氏烟中,该区域所产生的V-sRNA受到抑制,不再是V-sRNA所产生的热点区,取而代之的是,AC2和AC3的重叠区以及ACl的3'末端成为V-sRNA产生的热点区,表明TYLCCNB编码的βCl蛋白在TYLCCNB改变V-sRNA在TYLCCNV基因组上的分布中发挥了重要作用。对TYLCCNB而言,βCl作为症状决定因子,不管是否发生突变,均是S-sRNA产生的热点区。对病毒各个ORF的转录本含量进行分析表明冗余的病毒转录本有可能被植物的RNA依赖的RNA聚合酶(RDR)识别并且作为RDR合成dsRNA的模板,诱导次级sRNA的合成。
　　 2 TYLCCNB编码的βCl蛋白抑制甲基化介导的转录水平基因沉默研究
　　 对TYLCCNV抑制甲基化和转录水平基因沉默(Transcriptional gene silencing,TGS)开展了研究,亚硫酸氢盐测序表明TYLCCNV基因组DNA在TYLCCNV单独侵染的本氏烟中能够发生甲基化,且甲基化主要集中于病毒启动子区,包括基因间隔区(含有病毒复制起点和双向转录启动子)、AV2区(含有AV1／CP启动子)以及AC2／AC3的启动子区。TYLCCNB与TYLCCNV共同侵染能够降低TYLCCNV全基因组的甲基化水平,使其从5.4％降到1.25％。农杆菌接种实验表明TYLCCNB能够互补甜菜曲顶病毒(BCTV)L2-突变体,阻止次级侵染组织发生回复,使其胞嘧啶甲基化水平降低15％左右。胞嘧啶延伸实验表明TYLCCNB与TYLCCNV共同侵染本氏烟能够使寄主基因组的甲基化水平降低2.5倍左右。与甜菜曲顶病毒病毒(BCTV)不同的是,虽然TYLCCNV也编码了AC2／AL2蛋白,但是TYLCCNV整个病毒并不能有效的抑制TGS,而TYLCCNB与TYLCCNV或者BCTV L2-突变体共同接种却能够回复16-TGS本氏烟中转录水平沉默的GFP转基因的表达。βC1还能回复16-TGS本氏烟中转录水平沉默的GFP转基因的表达,并且能够激活拟南芥中F-box等内源表观沉默位点的表达,显著降低拟南芥基因组的甲基化水平。酵母双杂交和双分子荧光互补实验表明βCl能够在体内与甲基循环中的关键酶S一腺苷高半胍氨酸水解酶(SAHH)A作,体外SAHH活性测定试验表明βCl与SAHH互作后能够使SAHH的活性降低80％左右。上述研究及已有的报道表明双生病毒及其伴随的betasatellite编码的蛋白能够通过不同的方式抑制甲基循环的腺苷甲硫氨酸(SAM),从而达到抑制甲基化和TGS的效果。
　　 3番茄黄曲叶病毒自然种群的分子变异分析
　　 为了追踪番茄黄曲叶病毒(Tomatoyellow leaf curl virus,TYLCV)在我国的发生和进化规律,于2006到2010年从上海采集了26个TYLCV的分离物并且利用滚环扩增技术(RCA)获得122条TYLCV的全长基因组序列。序列分析表明所获得的122条TYLCV的全长基因组序列的同源性为98.5％-100％,且每年每个位点的平均替代率为1.69×10-3,表明TYLCV具有与RNA病毒相似的变异速度。对TYLCV的基因间隔区(IR)以及各个编码区的序列进行分子变异分析表明IR区的变异最大,且每年每个位点的平均替代率为4.81×10-3。进一步分析发现TYLCV的变异是由碱基替代引起的,且碱基替代存在一定的倾向性,主要偏向于C→T、T→C、G→A和G→T的转换。我们的研究结果进一步说明双生病毒具有与RNA病毒相似的进化变异速率。
　　 4番茄黄曲叶病毒在烟粉虱介体内的分子变异分析
　　 为了了解TYLCV在烟粉虱介体内的分子变异情况,以TYLCV侵染性克隆接种的番茄作为毒源分别让入侵Q型烟粉虱和土著ZHJ2型烟粉虱取食,并利用RCA技术测定烟粉虱取食12 h和15 d后其体内的TYLCV全长基因组序列。序列分析发现TYLCV在Q型和ZHJ2型烟粉虱体内的平均替代率分别为4.08×10-3和3.45×10-3,表明TYLCV在烟粉虱体内具有种群遗传多样性和快速的变异速率。遗传差异分析表明TYLCV在烟粉虱介体内的变异速率显著高于其在寄主番茄中的变异速率(2.02×104.3.66×104)。进一步分析发现,TYLCV在烟粉虱介体内的高突变频率是由于在多个位点频繁发生突变引起的,且突变类型存在一定的偏好性,偏向于C→T、G→A、A→G和T→G的转换,该研究结果表明烟粉虱可能在TYLCV的变异与进化中发挥了重要的作用。