酶解虾壳蛋白制备ACE抑制肽及抗氧化肽

摘要

随着我国水产养殖业的迅猛发展，到2010年，我国对虾总产量已突破350万吨。虾壳作为虾仁加工副产品被大量剩下，若不及时处理，会造成环境污染，同时也是资源的一种浪费。通过提取虾壳中蛋白质并对其功能性质进行研究，利用蛋白酶酶解虾壳制备ACE抑制肽和抗氧化肽，为虾壳蛋白作为食品添加剂和功能性食品提供了理论依据，为提高虾壳加工附加值提供思路。具体研究内容如下：
　　 虾壳中组成成分：水分10.95％、粗脂肪11.59％、粗蛋白41.37％、灰分21.26％、甲壳素17.91％。虾壳中蛋白含量较高且脂肪含量低，且通过氨基酸分析，虾壳中氨基酸含量丰富，疏水性氨基酸含量占总氨基酸的25.89％，具备制备ACE抑制肽和抗氧化肽的基本条件。利用碱提酸沉法从虾壳中提取蛋白质，对于其溶解性、持水性、持油性、起泡性、乳化性和密度等功能性质进行研究。采用Osborne法分级制备虾壳蛋白，虾壳中清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白比例为15:2:1:7。通过SDS-PAGE电泳分析，虾壳中主要蛋白分子量为13804Da。
　　 本文对ACE抑制肽构效进行分析，通过现有已发表的ACE抑制肽的部分参数进行数据整合处理，从中找出影响ACE抑制肽活性的有效因素，并揭示其与ACE抑制活性之间关系，为ACE抑制肽酶解和合成提供理论参考。当氨基酸残基较少时，ACE抑制肽具有较高活性。ACE抑制肽活性与残基个数和平均疏水性非常显著相关，与C端的疏水性显著相关。将上述3个参数进行主成分分析，主成分Ⅰ和主成分Ⅱ能够描述所选指标91.65％，并且其与ACE抑制活性关系明确，呈正相关，相关系数为0.3462。
　　 本文研究了酶解虾壳蛋白制备ACE抑制肽的工艺。以虾壳蛋白为原料，选用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶对其进行水解。以单酶水解产物ACE抑制率和水解度为评价指标，确定了中性蛋白酶和碱性蛋白酶为目标酶。通过单因素实验和正交实验，确定了这2种酶的最适水解条件：中性蛋白酶温度50℃、酶用量2000u/g、底物质量浓度2.5g/100mL、pH7、反应时间2h，ACE抑制率为84.04％；碱性蛋白酶温度60℃、酶用量4000u/g、底物质量浓度2.5g/100mL、pH9.5，反应时间2.5h，ACE抑制率为67.70％。酶解产物分别经过了10KDa和5KDa的膜超滤，发现当分子量小于5KDa时有最高的ACE抑制活性。利用凝胶层析分离中性蛋白酶和碱性蛋白酶分子量小于5000Da酶解产物，中性蛋白酶酶解产物分离得到5个峰，前4个峰分子量分别为794.88Da、569.77Da、456.35Da、262Da。碱性蛋白酶酶解产物分离得到3个峰，分子量分别为711.38Da、365.51Da、262Da，因此推断具有强ACE抑制活性肽为含有2-6个氨基酸短肽。
　　 在本研究中首次对虾壳蛋白酶解产物的抗氧化活性进行了探索。以虾壳蛋白为原料，选用碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶对其进行水解。以DPPH自由基清除率和FRAP还原能力为评价指标，选择碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶为目标酶，通过单因素实验和正交实验优化酶解工艺，确定酶解条件为：木瓜蛋白酶温度65℃、pH6.5、酶用量2000u/g、反应时间2.5h，DPPH自由基消除率为94％；当碱性蛋白酶底物质量分数温度50℃，pH10，酶用量3500u/g，底物质量分数为6.5g/100mL，反应时间2.5h，FRAP还原力为1.501nmol/mL。