乙肝病毒通过下调TRIF蛋白导致的先天免疫逃逸

摘要

背景：
　　乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)的感染是全球位居前十的死因，已明确被认为是肝硬化，原发性肝细胞肝癌的重要病因。根据2002年的世界肿瘤流行病学数据，当年发现的原发性肝癌有54.4％可以归咎于HBV的感染。目前以核苷类似物和α干扰素为主的治疗效果不甚理想。肝细胞作为病毒感染的靶细胞，虽然不是通常意义上的专职免疫细胞，但是由于它是病毒生长复制的场所，数量众多，而且研究发现肝细胞本身也存在着先天免疫通路和原始的免疫监视机制，因而宿主细胞层面的先天免疫在抑制HBV中的作用也得到了重视，并被许多研究所证实。为了自身的生存，HBV发展出了相应的策略来逃避免疫清除。因而，深入的研究HBV逃避宿主免疫的分子机制，有利于更好的理解乙肝病毒感染如何慢性化，并对其治疗提供新的策略选择，对从病因上更好的防控乙肝后肝硬化和肝癌的发生具有重要的意义。
　　目的：
　　肝细胞是乙型肝炎病毒感染的靶细胞，宿主细胞层面的对病毒的防御(intracellular host defence)在抑制乙肝病毒中的作用得到越来越多的重视。目前的研究发现激活肝细胞内的先天免疫机制能有效的抑制病毒。TRIF作为TLR3信号通路中重要的衔接蛋白，常常被感染的病毒(包括HAV和HCV)所劫持以发展免疫逃逸。本文将研究HBV的感染对肝细胞内。TRIF蛋白表达的调节，初步的探索是哪个病毒蛋白成分经何途径的调节；同时探讨了TRIF对肝细胞内HBV复制和表达的影响并试图阐述了相关的抗病毒分子机制。通过本研究，意图丰富对HBV逃避宿主细胞先天免疫机制的认识，为开发HBV的治疗提供新的理论上的策略选择。
　　方法：
　　1、在瞬时转染HBV表达质粒和空白质粒的肝癌细胞中，在稳定转染HBV的肝癌细胞与亲本细胞中，在以小RNA干扰技术沉默HBV表达的稳转肝癌细胞与对照细胞中，在13例HBV阴性的肝组织和12例HBV阳性的肝组织中，应用qRT-PCR与蛋白免疫印迹法分别在mRNA与蛋白水平检测TRIF的表达。初步分析HBV对肝细胞内TRIF蛋白的影响。
　　2、构建HBV病毒蛋白X，Core，LHBs，Polymerase的表达质粒，与空白质粒分别转染肝癌细胞，蛋白免疫印迹法检测TRIF表达以鉴别是哪个病毒蛋白导致了TRIF的改变。以野生型HBV质粒、X基因缺陷型HBVX-质粒、HBVX-联合X表达质粒转染肝癌细胞，以逐渐增量的X质粒转染肝癌细胞，以逐渐增量的X质粒和恒量的TRIF质粒共转染肝癌细胞，蛋白免疫印迹法检测TRIF表达进一步明确X蛋白的作用。转染X质粒的肝癌细胞，予蛋白酶体抑制剂MG132处理后再检测TRIF表达。以X质粒和TRIF质粒共转染肝癌细胞，免疫共沉淀检测X和TRIF是否存在相互作用。
　　3、向肝癌细胞中共转染TRIF质粒和HBV表达质粒，设置不表达TRIF的对照组，ELISA检测细胞培养上清中HBsAg、HBeAg浓度；裂解培养细胞，提取细胞内病毒颗粒内的HBV复制中间体DNA，以real-time PCR检测；qRT-PCR检测细胞内HBc mRNA的水平；蛋白免疫印迹法检测病毒蛋白HBc表达。向HBV稳转细胞HepG2.2.15中同样转染TRIF质粒和空白质粒，同上观察HBV的复制与表达。
　　4、在肝癌细胞内过表达TRIF蛋白，以双荧光素酶报告基因法观察NF-kB、ISRE的活化和IFN-β启动子的活化，以qRT-PCR检测受它们调节的基因TNF-α、ISG15和IFN-β的mRNA改变。为了观察NF-kB的活化在抑制HBV复制中的作用，在瞬时转染和稳定转染HBV的肝癌细胞中给予NF-kB抑制剂BAY11-7082处理，real-time PCR法检测HBV的表达与复制。在肝癌细胞中上调TRIF表达，通过显微镜观察细胞和细胞核的形态，检测caspase-3/7的活性反映细胞的凋亡。
　　结果：
　　1、所有表达HBV的肝癌细胞和HBV阳性的肝组织标本中，TRIF蛋白水平的表达降低。在稳定转染HBV的肝癌细胞与HBV阳性的肝组织标本中，TRIF的mRNA表达水平也明显下降，但与之不同的是，在瞬时转染HBV的肝癌细胞中，其mRNA表达水平无明显变化。以siRNA抑制稳转肝癌细胞中HBV的表达后，TRIF蛋白增加，基因表达无明显改变。
　　2、以之前所用的野生型含有129％病毒基因组长度的HBV质粒为模板，成功构建病毒蛋白X，Core，LHBs，Polymerase的表达质粒。我们发现正是X蛋白导致了肝癌细胞内TRIF蛋白表达的下降，并且这种抑制与X蛋白的表达呈剂量依赖关系。在野生型HBV质粒、X基因缺陷型HBVX-质粒、HBVX-联合X表达质粒转染肝癌细胞实验中，再次证实了X蛋白对TRIF的下调。蛋白酶体抑制剂MG132的处理抑制了X蛋白诱导的TRIF表达下调。在X质粒和TRIF质粒共转染肝癌细胞中，免疫共沉淀未能发现X和TRIF的相互作用。
　　3、在表达HBV的肝癌细胞中过表达TRIF蛋白，细胞培养上清中HBsAg、HBeAg水平降低，肝细胞内病毒颗粒中的HBV复制中间体DNA减少，细胞内HBcmRNA的水平下降；病毒蛋白HBc表达下降。
　　4、在肝癌细胞内过表达TRIF，促进了NF-kB、ISRE和IFN-β启动子的活化，受它们调节的基因TNF-α、ISG15和IFN-β的mRNA水平上升。阻断NF-kB的活化后能明显提高肝细胞内HBV的复制和表达。肝癌细胞中上调的TRIF表达诱导了细胞的凋亡。
　　结论：
　　1、HBV能下调TRIF蛋白的表达.但在瞬时转染模型和代表了HBV慢性持续感染状态的稳转HBV的肝癌细胞和慢性乙肝组织中，TRIF基因水平的表达显示出差异。HBV病毒的X蛋白介导了TRIF的蛋白水平下调。这种下调经蛋白酶体途径并呈剂量依赖性。
　　2、TRIF的表达，促进了肝细胞内NF-kB、ISRE和IFN-β启动子的活化，还诱导了细胞的凋亡，多个角度抑制了HBV的复制和表达。
　　3、基于以上结果，我们首次发现了HBV经下调肝细胞内TRIF蛋白而导致的先天免疫逃逸机制，有利于增进对HBV持续感染机制的理解，为HBV的治疗提供可能的新的策略。