绿色组织特异启动子驱动抗虫融合基因表达方法可以最小化Bt蛋白在水稻种子中的表达

摘要

许多转抗虫基因作物表达Bt杀虫蛋白已经被广泛应用于提高作物性状，例如玉米和棉花。然而对于转Bt基因水稻商业化种植生产，人们一直争论Bt蛋白在水稻种子中表达是否安全这个问题。同时随着越来越多的转Bt基因植物种植，并且多为转单一Bt毒素蛋白基因，昆虫抗性问题日益突出。针对以上问题，本项实验研究采用绿色组织特异表达和融合抗虫基因方法。构建两个转化载体pGreen-Cry1Ac-223和pZmUbi-Cry1Ac-223，将cry1Ac基因和223基因融合在一起形成cry1Ac-223虫基因，分别采用pGreen绿色组织特异启动子和ZmUbi启动子来指导融合抗虫基因表达，以抗草甘膦基因G10作为筛选标记，对比研究pGreen启动子的特异性和促进基因表达能力。农杆菌介导转化方法获得抗虫抗草甘膦的转基因水稻株系。在温室中，利用棉铃虫对转基因水稻进行抗虫生物测定，获得转融合抗虫基因水稻阳性株系。对阳性株系草甘膦活性测定，结果发现转基因水稻有很好的抗性。利用western blot分析来比较pGreen启动子和ZmUbi启动子驱动融合基因表达能力，证实携带pGreen启动子水稻株系融合基因只在绿色组织中特异表达，而在种子中几乎检测不到，低于17ng/g。对转基因水稻进行田间评估和southern blot分析，鉴定得到单拷贝，结合农艺性状分析选取优秀株系S20，借助Tail-PCR和普通PCR方法确定T-DNA插入位点。在田间实验条件下，利用水稻二化螟和稻纵卷叶螟进行抗虫生物测定，结果显示转基因水稻株系S20具有很好的抗虫性能。喷施草甘膦，挑选S20株系纯和植株，为培育水稻新品种和进一步研究提供材料。

目录

声明

致谢

摘要

1 文献综述

1．1 高等植物绿色组织特异性表达启动子研究进展

1．1．1．高等植物绿色组织特异性表达启动子的种类

1．1．2 绿色组织特异启动子的调控元件

1．2 Cry蛋白研究进展

1．2．1 cry基因分类

1．2．2 Cry蛋白结构

1．2．3 Cry蛋白毒杀鳞翅目害虫的作用机理

1．2．4 Cry1Ac和223

1．3 抗虫转基因水稻存在的问题

1．4 有关转抗虫基因水稻存在问题的主要应对措施

1．4．1．根据Cry蛋白杀虫机制改造抗虫基因

1．4．2 多基因堆积策略

1．4．3 选择合适启动子控制基因定时定位表达

1．5 研究目的和意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．2 方法

2．2．1 分子基础实验操作方法

2．2．2 载体构建

2．2．3 农杆菌介导的水稻转化

2．2．4 转基因水稻鉴定

2．2．5 实验中应用的引物

3 结果与分析

3．1 组培转化获得转基因水稻植株

3．2 T0代转基因水稻分析

3．2．1 转基因水稻幼苗对棉铃虫的抗性

3．2．2 Western blot检测转基因株系抗虫蛋白表达水平

3．2．3 携带pGreen启动子转基因株系对草甘膦的抗性

3．3 转基因株系叶片和种子蛋白表达水平对比

3．3．1 不同启动子作用抗虫基因蛋白表达水平对比

3．3．2 携带pGreen启动子株系叶片和种子表达蛋白定量

3．4 T-DNA数目和插入位点分析

3．4．1 Southern blot分析T-DNA插入数目

3．4．2 转基因水稻株系S20 T-DNA侧翼序列分析

3．5 转基因水稻T1代S20株系分析

3．5．1 S20株系对二化螟和稻纵卷叶螟的抗性

3．5．2 S20株系抗虫蛋白表达水平测定

3．5．3 S20株系农艺性状分析

3．6 转基因水稻S20株系T2代挑选纯和植株

4 小结与讨论

参考文献

作者简历