Caco-2细胞中空纤维反应器的构建及其对口服药物吸收的预测

摘要

随着制药工业的飞速发展，制药公司不断开发出大量新的化合物作为候选药物。具有合适的小肠吸收比率与口服生物利用度，是候选药物开发为口服药物的先决条件。制药公司往往使用模拟小肠吸收功能与肝脏代谢功能的体外模型对药物的上述性质进行评价，以便在研发的早期阶段快速判断其开发潜力。插入式半透滤膜上培养的Caco-2细胞单层是最为经典、应用最为广泛的一种评价药物口服吸收比率的体外模型。但是这种模型培养周期长达21天，并且存在着操作复杂、耗费较大、筛选通量不高等问题。本课题拟构建基于中空纤维且能够模拟人体小肠微观形态的生物反应器，使Caco-2细胞在中空纤维膜内贴壁生长并快速分化以缩短培养周期，同时促进Caco-2细胞充分表达出小肠上皮所具有的特有生理功能，以实现对药物口服吸收行为简便而准确的预测。
　　基于此目的，本文首先筛选出了适于Caco-2细胞贴壁生长的聚醚砜(PES)中空纤维，并利用步进电机驱动促使Caco-2细胞在PES中空纤维内表面均匀贴壁生长。细胞形态学及渗透实验表明:该反应器中，Caco-2细胞层于接种5天后达到充分融合;刷状缘膜酶系（包括碱性磷酸酶和谷氨酰转移酶）以及转运蛋白(P-糖蛋白和多要耐药相关蛋白2)的活性检测表明:Caco-2细胞于接种后7天内完成功能分化并且活性水平高于插入式半透滤膜上培养21天的细胞。可见，该反应器的培养周期相对于传统培养模型大为缩短。此外，通过PES平板膜和中空纤维培养Caco-2细胞的分化速度比较，发现中空纤维的特殊空间构型可能是促进细胞快速分化的主要因素。
　　随后，本文对比了该反应器与传统模型用于药物口服吸收预测的效果。16种药物的口服吸收预测结果在两种模型中呈现相似的趋势和预测精度(R2＞0.87);作为转运蛋白底物的3种药物，其外排现象在反应器中能够充分体现。此外，本文还将该反应器与本实验室已有的微型化肝细胞生物反应器联合使用，初步实现了小肠-肝脏联合反应器的构建，对4种药物口服生物利用度的预测值与体内数据较为接近。
　　总之，在PES中空纤维内培养的Caco-2细胞在7天内形成了完整致密且功能完善的细胞单层。该反应器可用于评价口服药物在小肠的吸收能力，同时，初步构建的小肠-肝脏联合反应器也为体外评价药物口服生物利用度提供了新的手段。

目录

声明

致谢

摘要

缩略词表

引言

第1章 文献综述

1．1 口服药物在小肠内的吸收

1．1．1 小肠的生理结构

1．1．2 口服药物小肠内吸收的途径

1．2 体外预测口服药物小肠吸收比率的方法

1．2．1 非生物模型

1．2．2 生物模型

1．3 Caco-2细胞模型的构楚与进展

1．3．1 Caco-2细胞单层经典培养模型的建立

1．3．2 Caco-2细胞单层经典培养模型的缺陷与改进

1．3．3 新型Caco-2细胞模型

1．4 药物口服生物利用度的预测

1．5 课题主要研究思路

第2章 材料与方法

2．1 细胞株

2．2 主要试剂与仪器

2．2．1 主要试剂

2．2．2 仪器设备

2．3 Caco-2细胞的培养

2．3．1 Caco-2细胞培养及传代

2．3．2 平板膜上Caco-2的培养

2．3．3 中空纤维膜内表面上Caco-2的培养

2．4 体外细胞功能分析

2．4．1 细胞计数

2．4．2 细胞琥珀酸脱氢酶染色及酶活测定(MTT法)

2．4．3 细胞转运蛋白活性测定

2．4．4 扫描电子显徼镜观察

2．4．5 透射电子显徼镜检测

2．4．6 F-actin与Zonula occludens-1 protein(ZO-1)的荧光染色

2．4．7 细胞层旁路渗透的检测

2．4．8 碱性磷酸酶(ALP)活性测定

2．4．9 γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)活性测定

2．5 药物表观渗透速率的测定与计算

2．6 根据肝固有清除率推测药物口服生物利用度

2．7 肝肠联合培养模型对药物口服生物利用度的预测

2．8 样品检测

2．9 统计学分析

第3章 Caco-2细胞中空纤维反应器的构建

3．1 引言

3．2 适合Caco-2细胞贴壁生长中空纤维的筛选

3．3 中空纤维内表面上Caco-2细胞的旋转贴壁培养

3．4 PES中空纤维膜的表面形貌

3．5 PES中空纤维膜内表面上Caco-2细胞的生长

3．6 本章小结

第4章 中空纤维反应器内Caco-2细胞功能分析

4．1 引言

4．2 中空纤维反应器内Caco-2细胞功能表征

4．2．1 Caco-2细胞层的旁路渗透性质

4．2．2 Caco-2细胞琥珀酸脱氢肆活性

4．2．3 Caco-2细胞层内细胞骨架与紧密连接网络的完整性

4．2．4 Caco-2细胞内刷状缘膜酶系的活性

4．2．5 Caco-2细胞内转运蛋白的活性

4．2．6 中空纤维反应器与Transwell?模型内Caco-2细胞分化对比

4．3 PES中空纤维反应器内Caco-2细胞快速分化原因探索

4．4 本章小结

第5章 Caco-2细胞反应器用于口服药物吸收和生物利用度预测

5．1 引言

5．2 Caco-2细胞反应器用于口服药物吸收行为的预测

5．2．1 药物口服吸收比率的预测

5．2．2 P-gP和MRP2对药物的转运

5．3 Caco-2细胞反应器用于药物口服生物利用度的预测

5．3．1 肠肝反应器分别预测药物的吸收与肝脏代谢

5．3．2 肠肝联合生物反应器预测药物口服生物利用度

5．3．3 两种预测药物口服生物利用度方法的对比

5．4 本章小结

第6章 结论与展望

6．1 总结

6．2 论文主要创新点

6．3 不足之处

6．4 展望

参考文献

攻读学位期间的科研成果