小鼠胰腺癌演进中髓系来源抑制细胞的动态变化及体外诱导肿瘤相关巨噬细胞分化的研究

摘要

背景与目的：
　　胰腺癌免疫治疗为近年来研究热点，进行体内免疫治疗研究最重要一步为建立免疫健全小鼠的胰腺癌动物模型，从而更好的模拟人胰腺癌的肿瘤微环境。髓系来源抑制细胞(myeloid derived suppressor cells，MDSC)与肿瘤相关巨噬细胞（tumor associated macrophages，TAM）为重要的两群肿瘤免疫调节细胞，可抑制多种免疫效应细胞的功能，与肿瘤的发生、进展密切相关。本研究尝试利用小鼠胰腺癌细胞系Panc02细胞建立小鼠胰腺癌皮下移植瘤模型，并进一步观察荷瘤鼠胰腺癌在发生发展过程中MDSC的动态变化。同时尝试利用Panc02培养上清液体外诱导小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7向TAM分化。
　　方法：
　　体外培养Panc02细胞，将处于对数生长期的1×106个/100μl肿瘤细胞接种于C57BL/6J小鼠左前腋窝皮下，观察肿瘤生长变化情况，择时取材切片做H&E染色。根据瘤体大小，将肿瘤定义为Tx期（可疑瘤体形成）、T1期（0＜瘤体体积≦500mm3）、T2期（500mm3＜瘤体体积≦1750mm3）、T3期（1750mm3＜瘤体体积≦4000mm3）、T4期（4000mm3＜瘤体体积）。分别取荷瘤鼠与正常鼠外周血、脾脏行流式染色。然后分析外周血和脾脏中CD11b+Gr-1+MDSC及其亚群（CD11b+Ly6C+MDSC、CD11b+Ly6G+MDSC）动态变化。用小鼠胰腺癌Panc02细胞系的培养上清刺激单核巨噬细胞系RAW264.7，诱导72小时后收集细胞，流式细胞仪上机检测RAW264.7向TAM分化情况。
　　结果：
　　小鼠平均成瘤时间约为12天，成瘤率100％，接种后3-4周进入快速生长期。肿瘤质地较硬，晚期表面可有破溃出血。皮下瘤组织病理切片H&E染色后可见组织细胞排列混乱、极性消失，细胞核分裂相多见、异型性明显，并可见不典型腺腔结构及播散分布的癌巢，符合恶性导管上皮样癌表现。正常对照小鼠外周血CD11b+Gr-1+细胞群为7.3％，Tx、 T1、T2、T3、T4外周血CD11b+Gr-1+细胞群分别为3.7％、4.9％、11.6％、16.7％、25％;正常对照小鼠外周血中CD11b+Ly6C+、CD11b+Ly6G+细胞群分别为6.2％和4.8％，Tx、T1、T2、T3、T4外周血中CD11b+Ly6C+细胞群分别为4.9％、12.6％、8.5％、18％、24.7％，CD11b+Ly6G+细胞群分别为3.8％、9.5％、6.6％、19.9％、24.9％。正常对照小鼠脾标本中CD11b+Gr-1+细胞群为3.4％，CD11b+Ly6C+、CD11b+Ly6G+细胞群分别为3.9％和3.6％; T4荷瘤小鼠脾标本中CD11b+Gr-1+细胞群为20.4％，CD11b+Ly6C+、CD11b+Ly6G+细胞群分别为15.5％和13.9％。肿瘤上清液刺激RAW264.7后M1型（F4/80+CD16/32+）及M2型(F4/80+CD206+)TAM较对照组均明显升高(44.2％vs28.5％，18.5％vs9.4％)，尤以M2型升高比例更多。
　　结论：
　　小鼠胰腺癌皮下移植瘤模型构建成功，其成瘤时间短，成瘤率高，为研究胰腺癌的肿瘤免疫学提供了可靠保障。小鼠外周血中MDSC及其亚群与胰腺癌肿瘤负荷有一定的正相关联系。晚期荷瘤小鼠脾脏中MDSC及其亚群较正常小鼠明显升高。小鼠胰腺癌Panc02细胞系细胞培养上清液可诱导单核巨噬细胞向M1、M2分化，M2升高比例尤为明显。

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致谢

摘要

缩略语表

1 引言

2 实验材料和主要仪器

2．1 实验动物和细胞系

2．2 主要试剂及其配制

2．3 实验仪器

3 实验方法

3．1 建立小鼠胰腺癌皮下移植瘤模型

3．2 小鼠外周血、脾脏获取及MDSC变化分析

3．3 体外诱导刺激单核巨噬细胞分化

4 结果

4．1 建立小鼠胰腺癌皮下移植瘤模型

4．2 小鼠外周血、脾脏获取及MDSC变化

4．3 体外诱导刺激单核巨噬细胞分化

5 讨论

6 结论

参考文献

综述 胰腺癌动物模型的建立方法及应用

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