凡纳滨对虾抗对虾白斑综合症病毒感染研究

摘要

近20年来，对虾白斑综合症病毒病一直是业内研究的热点。从最初的形态学观察，到各种抗病毒免疫相关基因的鉴定，都倾注了研究者们的大量心血。但是到目前为止这个“谜团”似乎还没有揭开的迹象。我们认为免疫反应是一个交互作用的复杂过程，只有从组学的角度上阐释对虾和病毒相互作用的分子机制，深入了解对虾的抗病毒免疫机理，才能有的放矢地控制病毒的发生与流行。测序技术的飞速发展为我们想法的实现提供了一个良好的平台。
　　 基于Illumina/Solexa高通量测序平台的转录组测序技术能够对任意物种的整体转录组情况进行检测，发现未知和稀有转录本，提供最全面的转录组信息;数字基因表达谱技术能够分析不同处理状态下的基因表达水平。与传统的测序技术相比，Illumina/Solexa测序技术具有高通量，快速和准确等特点。
　　 本研究以感染WSSV的凡纳滨对虾血淋巴为研究对象，应用Illumina/Solexa高通量测序技术对血淋巴的转录组进行深度测序。使用短序列组装软件SOAPdenovo对测序结果进行从头组装，建立凡纳滨对虾血淋巴转录组数据库;将转录组数据与nr、Swiss-Prot、KEGG和COG等数据库进行序列比对、功能注释和代谢通路分析;利用数字基因表达谱技术对WSSV感染早期和晚期的差异表达基因进行筛选;并筛选了部分基因做功能鉴定。取得的结果和结论如下:
　　 1、转录组测序共获得2，581多万条90bp的高质量配对短序列。采用短序列组装软件SOAPdenovo进行序列组装，共获得52，073条unigenes，平均长度为520nt，N50值为745nt，测序质量评价结果表明，除了3’端和5’端存在少量reads外，其它reads的分布都相对均一。该研究成果极大地丰富了凡纳滨对虾转录组数据库，为发现新基因及分析差异表达基因奠定了坚实的基础。
　　 2、在组装获得的52，073条unigenes中，有23，568条unigenes可以注释到四个数据库;通过GO功能注释，共有6，562条unigenes被归类到50个功能分类中，这些功能分类主要涉及代谢相关，生长和发育调控，凋亡，生物合成，免疫防御，分子加工，信号传导及转录调节等;通过COG功能分类，共有7，822条unigenes被归类到25个功能类别中;通过KEGG代谢通路分析，共有14，941条unigenes注释到240个信号通路中;CDS预测表明有20，689条unigenes可以预测到蛋白编码框，其余未被预测到蛋白编码框的序列用ESTscan软件进行编码区预测，结果表明有5，669条可能为新的蛋白编码序列;KEGG分析显示有963条unigenes被显著富集到各个免疫相关的信号通路中，如泛素介导的蛋白酶水解通路，MAPK信号通路，jak-STAT信号通路和钙代谢信号通路等;从被注释到的基因中筛选到约有1，179条unigenes与其它物种的免疫相关基因具有相似性。由以上结果我们可以推测对虾的抗病毒免疫系统是一个由多个因子参与，涉及多个信号通路的复杂的生物反应过程。
　　 3、利用DGE测序技术，分别对LO样品（对照样），L1样品（WSSV感染后5h样品）和L2样品（WSSV感染后48h）进行分析，三个样品均获得约6千万条高质量的表达序列标签;通过测序质量分析，测序饱和度和均一度评价，基因覆盖度分析，表明所获得的tags可以用作进一步的差异表达基因分析;将三个样本的tags比对回转录组，比较分析发现在病毒感染的早期，仅有315个差异表达基因，包括227个上调表达基因和88个下调表达基因;而在病毒感染的晚期，共有4，226个差异表达基因，包括2506个上调表达基因和1720个下调表达基因;GO功能注释表明，这些差异基因分别富集到不可溶解部分，肽酶活性和细胞氨基酸代谢过程等GO条目中;KEGG代谢通路分析表明，病毒感染晚期的差异表达基因大多富集到细胞外基质受体相互作用，补充和凝固级联，抗原加工和递呈等信号通路中;qRT-PCR实验验证表明所选四个基因的表达模式与DGE的测序结果趋势一致。通过以上分析结果我们可以得知，在病毒感染的早期，对虾的免疫反应是迟缓的，而在病毒感染的晚期，对虾的免疫系统才被充分激活。
　　 4、在转录组和数字基因表达谱测序结果分析的基础上，选取18个免疫相关基因，通过分析在严重感染频死的对虾血淋巴中这些基因的表达情况，筛选出6个表达量与对照组具有显著性差异的基因。其中胰凝乳样丝氨酸蛋白酶基因显著上调表达，其余五个基因包括热激蛋白70，对虾肽，粘性因子，增殖细胞核抗原和Argonaute显著下调表达;体外合成胰凝乳样丝氨酸蛋白酶的双链RNA，通过注射方法沉默该基因的表达，沉默效率实验表明在注射双链RNA24h后该基因即被沉默表达。沉默表达CH-SPase基因后，注射感染WSSV，发现实验组的对虾死亡率比对照组显著下降。病毒的拷贝数和VP28的表达量都相应降低。提示该基因在病毒侵染过程中起到了协助WSSV入侵的作用。

目录

声明

摘要

常用缩略词表

第1章 研究背景

1．1 对虾白斑综合症病毒研究概况

1．1．1 WSSV的危害，形态结构及组织病理学特点

1．1．2 WSSV的宿主范围及可能的传播途径

1．1．3 WSSV基因组结构特征

1．1．4 WSSV感染不同时程基因表达研究

1．2 对虾免疫防御机制研究进展

1．2．1 物理防御

1．2．2 细胞免疫

1．2．3 体液免疫

1．2．4 对虾抗病毒免疫研究存在问题

1．3．转录组学研究方法及测序技术发展与应用

1．3．1 转录组学研究的基本方法

1．3．2 Illumina／Solexa测序技术应用研究进展

1．3．3 对虾转录组研究现状

1．4 本课题研究的目的和意义

1．5 本研究技术路线

第2章 凡纳滨对虾血淋巴转录组测序

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 实验材料

2．2．2 主要试剂

2．2．3 主要仪器

2．2．4 实验方法

2．2．5 文库测序

2．2．6 测序数据处理及分析

2．3 结果

2．3．1 RNA样品的制备及质量评价

2．3．2 测序产量统计及质量评价

2．3．3 De novo序列组装结果

2．3．4 组装序列质量评价

2．4 讨论

2．5 本章小结

第3章 unigenes功能注释及代谢通路分析

3．1 引言

3．2 分析方法

3．3 分析结果

3．3．1 数据库比对结果

3．3．2 GO功能分类

3．3．3 COG功能分类

3．3．4 KEGG代谢通路分析

3．3．5 蛋白编码框预测

3．3．6 凡纳滨对虾抗病毒免疫相关基因分析

3．4 讨论

3．5 本章小结

第4章 WSSV感染不同时期的数字基因表达谱分析

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．3 测序文库构建及Illumina测序

4．4 测序结果分析方法

4．4．1 Tags的去冗余与比对分析

4．4．2 差异表达基因的鉴定

4．4．3 差异表达基因的qPCR验证

4．5 结果

4．5．1 DGE测序评估

4．5．2 差异表达基因筛选

4．5．3 差异表达基因的功能注释

4．5．4 DGE分析的实验验证

4．6 讨论

4．7 本章小结

第5章 胰凝乳样丝氨酸蛋白酶在WSSV侵染过程中的作用研究

5．1 引言

5．2 材料与方法

5．2．1 实验材料

5．2．2 主要试剂和仪器

5．2．3 实验设计

5．2．4 WSSV的检测及粗提液制备

5．2．5 WSSV的定量

5．2．6 RNA提取及cDNA合成

5．2．7 免疫相关基因的表达分析

5．2．8 胰凝乳样丝氨酸蛋白酶(CH-SPase)在注射感染WSSV时其表达模式分析

5．2．9 CH-SPase基因的沉默表达对感染WSSV的对虾死亡率及病毒增殖的影响

5．3 结果

5．3．1 WSSV定量标准曲线的建立

5．3．2 自然感染WSSV的对虾血淋巴中18个免疫相关基因的表达模式分析

5．3．3 CH-SPase在WSSV感染进程中的表达模式分析

5．3．4 dsRNA的体外合成及检测

5．3．5 CH-SPase dsRNA干扰效率的确定

5．3．6 CH-SPase基因的沉默对感染WSSV的对虾死亡率的影响

5．3．7 CH-SPase基因的沉默对感染WSSV的对虾体内病毒增殖的影响

5．4 讨论

5．5 本章小结

主要的结果结论与创新点

参考文献

附录

在学期间所取得的科研成果

致谢