三种转Bt基因玉米的抗虫性评估及其对非靶标经济昆虫家蚕和捕食性天敌瓢虫的安全性评价

摘要

转Bt基因抗虫玉米是目前世界上种植面积最广的转基因作物之一，自1996年商业化推广以来，已有17个国家种植转Bt基因玉米，至2012年，具有Bt抗虫性状的玉米的种植面积超过6千万公顷，占玉米总种植面积的35％。然而靶标害虫会对Bt玉米产生抗性一直威胁着Bt玉米的可持续利用，而且Bt玉米的生态安全性也是人们关注的焦点。目前，将多个杀虫基因转入同一植株成为开发抗虫转基因玉米的趋势，大量实验数据表明，转入多个抗虫基因的玉米不但能扩大杀虫范围，增强抗虫性，对延缓害虫抗性产生和抗性治理方面也具有极大的优势。本论文评价了三种表达融合蛋白的转Bt基因玉米的抗虫性及其在延缓害虫抗性产生和抗性治理上的潜力，同时评估了其对非靶标生物家蚕和瓢虫的环境安全性，为我国玉米育种提供备选材料，并为其环境释放提供实验数据和理论支持。 主要结果如下: 以7个转cry1Ab/cry2Aj玉米事件(N10-N70)、1个转cry1Ab/vip3 DA玉米事件(V3)和1个转cry1Ab/cry1I(J223)和非转基因亲本HindⅡ的不同组织，包括叶片、雄穗、花丝、苞叶和雌穗对靶标害虫亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis敏感种群室内生测结果表明，取食Bt玉米的亚洲玉米螟初孵幼虫在48 h的死亡率达到69.2-99.3％，168 h后全部死亡，而且Bt玉米的取食叶面积显著低于非转基因对照。2011年春、夏两季玉米田间人工接虫后，Bt玉米的食叶级别为1.0-1.5，仅有个别叶片有针孔状虫孔，而对照玉米部分植株叶片有绿豆大小虫孔，平均食叶级别为3.9和5.0，差异显著。剖杆调查没有发现Bt玉米植株有虫孔或存活的幼虫和蛹，雌穗也没有被害状。以上结果说明9个转化事件在整个生育期内对亚洲玉米螟有很好的防治效果，可以防治心叶期和穗期玉米螟为害。而且综合评价认为，转cry1Ab/cry2Aj玉米7个转化事件中N30品系抗性最佳。 Cry1Ab抗性玉米螟取食N30、 V3和J223花丝和雌穗的死亡率差异较大，取食N30和V3的花丝和雌穗的玉米螟96 h后死亡率达到95.00％，168 h后全部死亡，而取食J223花丝和雌穗的幼虫在168 h后死亡率只有12.50％和20.83％，与对照没有显著性差异，大部分J223存活幼虫与对照一样，均已达到3龄末4龄初，体重也没有显著性差异。 室内生物学测试表明N30、V3和J223对棉铃虫Helicoverpa armigera有较高的抗虫性，96 h后的死亡率在90.00％左右。斜纹夜蛾Prodenia litura初孵幼虫取食Bt玉米叶片和雌穗48 h后死亡率只有10.00％左右，168 h后才到达90.00％以上。N30、V3和J223对甜菜夜蛾Spodoptera exigua没有明显的致死作用，但能够抑制其生长发育，与对照相比，体重抑制率在85.00％以上。 以上结果表明转cry1Ab/cry2Aj和cry1Ab/vip3DA玉米对靶标主要害虫和次要害虫都有较好的防治效果，并在玉米螟的抗性治理上有很大的应用潜力。 N30、V3和J223的花粉以40 mg/ml，约10000粒/cm2的密度涂在桑叶上时，家蚕Bombyx mori在14 d后全部死亡，而且大部分蚁蚕无法蜕皮进入下一个生长阶段。当桑叶上花粉密度为4 mg/ml，约1000粒/cm2时，对家蚕幼虫存活没有不利影响，但各龄眠蚕体重减轻，发育历期延长，但茧重和茧壳重与取食非转基因玉米花粉和无花粉的对照相比没有显著差异。当桑叶上的花粉密度为0.4mg/ml，约100粒/cm2时，家蚕的生长发育不受Bt花粉的影响。在实际环境中，桑叶上花粉的密度很难达到1000粒/cm2，Bt玉米不会对家蚕养殖带来影响。 以取食N30、V3、J223和对照玉米雌穗的甜菜夜蛾饲喂异色瓢虫Harmoniaaxyridis，幼虫至蛹的存活率分别为45.95％、29.73％、40.54％和41.89％，至羽化的存活率分别为31.08％、20.27％、28.38％和35.14％。幼虫发育历期、蛹期、蛹重及雌雄成虫重、产卵前期和产卵量与对照相比没有显著性差异。Cry1Ab蛋白沿着玉米-甜菜夜蛾-瓢虫食物链流动，但没有在瓢虫体内富集和积累。以花粉直接饲喂异色瓢虫成虫，7d和30 d后取食N30、V3、J223花粉的雌雄虫的体重与取食对照花粉的雌雄虫体重没有显著差异，30d后雌虫的存活率、产卵量和卵孵化园也与对照没有显著差异。以上结果说明N30、V3和J223对异色瓢虫的生长发育没有不利影响。 综上所述，转Bt基因玉米N30和V3对玉米主要害虫亚洲玉米螟，次要害虫棉铃虫、甜菜夜蛾和斜纹夜蛾有较高的防治效果，且有防治Cry1Ab抗性玉米螟的潜力。其花粉在桑叶上的密度为1000粒/cm2时对非靶标经济昆虫家蚕生长发育有不利影响，但实际环境中很难达到这一浓度。捕食性天敌异色瓢虫可以通过猎物和花粉接触到其表达的杀虫蛋白，但是存活率和生长发育等各项生物学指标没有受影响。因此，推荐N30和V3作为开发新型抗虫转基因玉米的备选材料。

目录

声明

论文说明

致谢

摘要

附表1 玉米抗螟性田问鉴定评价标准

附表2 玉米穗期受亚洲玉米螟为害程度的分级标准

前言

第一章 文献综述

1．1 转Bt基因作物发展背景

1．2 转聚合基因作物发展状况

1．3 获得转聚合基因作物方法

1．4 转聚合基因作物抗虫优势

1．4．1 靶标害虫产生抗性情况

1．4．2 高剂量／庇护所策略的限制

1．4．3 转聚合基因作物抗虫优势

1．4．4 转聚合基因作物的限制

1．5 转Bt基因玉米的生态安全性研究进展

1．5．1 Bt玉米的生态安全评估方法

1．5．2 Bt玉米对非靶标生物的影响

第二章 三种转Bt基因玉米对四种靶标害虫的抗虫性评价

2．1 材料与方法

2．1．1 供试玉米

2．1．2 供试昆虫

2．1．3 室内抗虫性鉴定

2．1．4 田间抗虫性鉴定

2．1．5 Cry1Ab蛋白表达量测定

2．1．6 数据统计与分析

2．2 结果与分析

2．2．1 室内生测结果

2．2．2 田间抗虫性鉴定结果

2．2．3 Cry1Ab蛋白表达含量测定

2．2．4 Topsis分析

2．3 讨论

第三章 三种转Bt基因玉米花粉对家蚕的安全性评价

3．1 材料与方法

3．1．1 供试玉米

3．1．2 供试家蚕

3．1．3 转融合基因玉米花粉对家蚕生物学影响

3．1．4 转Bt基因玉米花粉中Bt蛋白含量测定

3．1．5 家蚕对花粉的消化情况

3．1．6 数据分析

3．2 结果与分析

3．2．1 幼虫存活率

3．2．2 各龄眠蚕、茧和茧壳重

3．2．3 转Bt基因玉米花粉对家蚕发育历期的影响

3．2．4 转Bt基因玉米花粉对家蚕化蛹率、羽化率和产卵量

3．2．5 转Bt基因玉米花粉Cry1Ab蛋白含量及家蚕对花粉的消化情况

3．3 讨论

第四章 转Bt基因玉米对非靶标捕食性天敌-异色瓢虫的风险评估

4．1 材料与方法

4．1．1 供试玉米

4．1．2 供试昆虫

4．1．3 转Bt基因玉米通过甜菜夜蛾对异色瓢虫的生物学影响

4．1．4 Bt蛋白在玉米-甜菜夜蛾-异色瓢虫食物链中的流动

4．1．5 转Bt基因玉米花粉对异色瓢虫成虫寿命和生殖力的影响

4．1．6 统计分析

4．2 结果与分析

4．2．1 转基因玉米通过猎物甜菜夜蛾对异色瓢虫的生物学影响

4．2．2 Cry1Ab蛋白在转基因玉米-甜菜夜蛾-异色瓢虫中的流动

4．2．3 转基因玉米花粉对异色瓢虫成虫的生物学影响

4．3 讨论

第五章 总讨论

参考文献