尺寸可控高分子纳米颗粒的制备及其应用于纳米药物的研究

摘要

随着纳米技术的发展，纳米药物用于肿瘤的治疗已成为生物医学研究领域的重要前沿和热点之一。纳米药物载体的优势是可以改善药物的代谢动力学和改变药物的组织分布，从而提高疗效和降低毒副作用。己有研究表明纳米颗粒的稳定性、尺寸大小以及表面的聚乙二醇(PEG)是影响其药代动力学和肿瘤靶向的重要因素。然而，制备稳定的、PEG化以及具有尺寸可控的纳米颗粒通常需要多步来完成。在本文中，利用点击化学反应，我们一锅法制备具有内核交联、尺寸可控、表面PEG化的纳米颗粒(CNPs)。通过简单调节反应体系中大分子单体聚乙二醇丙烯酸酯(mPEG-AC)、二丙烯酸乙烯酯(EGDA)以及含有六个巯基的交联剂(TLA-6SH)的摩尔比例，纳米颗粒的尺寸可在10-90 nm内可控调节。该纳米颗粒很容易分散在水中且具有良好的生物相容性。此外，其内部疏水的空腔可以包埋药物，而内部未反应的巯基与丙烯酸酯官能团可以偶联药物或成像标记。因此，该纳米颗粒提供了一个多功能的药物输送平台。
　　纳米药物肿瘤治疗的过程可分为三个过程:经EPR传递到肿瘤部位;有效渗透到达肿瘤细胞并与其相互作用;最后进入细胞将自由的药物释放到药物作用靶点(如DNA)附近，使其发挥药效。这一体内药物输送过程遭遇多级屏障:系统屏障，肿瘤组织屏障，细胞屏障。因此，纳米药物必须同时成功地克服这些屏障才能实现高疗效与低毒副作用的目标。然而，很多关于纳米药物输送的研究在药物进入肿瘤细胞后多是在分散在细胞质中，很少在细胞核中。临床应用的抗癌药物中大部分是作用细胞核中的DNA，如葸环类抗生素(Anthracyclines)、顺铂(Cisplatin)和喜树碱(CPT)等，它们通过损伤癌细胞核内的DNA或抑制拓扑异构酶来诱导细胞凋亡而发挥疗效。然而，细胞的通过多种耐药机制限制抗癌药物进入细胞核，使肿瘤对药物产生耐药性，导致治疗的失败。因此，如果能够绕过这些耐药机制将药物直接输送到细胞核内，就可能提高药物的疗效。最近，β-羧基酰胺化的阳离子聚合物如聚乙烯亚胺(PEI)等应用于一类新型细胞核靶向的药物载体，用于将抗癌药物直接输送到细胞核中，从而使药物避开肿瘤细胞膜及细胞浆中的多种耐药机制，显著提高了疗效。在论文的第二部分我们制备了一种新型的具有电荷翻转能力的聚酯树枝状大分子(G4.5-DCA)并包埋了抗癌药物阿霉素(DOX)，与两嵌段聚乙二醇-b-聚赖氨酸共聚物(PEG-b-PLL)静电自组装得到一系列尺寸可控的纳米药物。由于纳米药物表面的PEG不仅可以阻止药物在生理条件下的突释，还可以减少网状内皮系统(reticuloendothelial system，RES)的摄取，延长血液中的滞留时间，从而增强肿瘤组织的高通透性和滞留效应(EPR)效应。当纳米药物被癌细胞内吞并进入酸性的溶酶体后，由于树枝状大分子表面的β-羧基酰胺键很快水解为胺基，从而使得自组装纳米药物发生解离;带有正电荷的树枝状大分子能够逃离溶酶体并进入细胞核，将药物输送到细胞核中。体外细胞毒性实验表明与游离阿霉素相比该纳米药物显著提高了细胞毒性。
　　具体工作包括以下几个方面:
　　第一章为文献综述，简要总结了纳米药物的分类、发展历程以及最新进展。
　　第二章的主要内容是不同尺寸纳米颗粒的合成与表征及载药研究。以mPEG-AC与EGDA为起始原料，TLA-6SH为交联剂，通过巯基与丙烯酸酯的点击反应制备了不同尺寸的硫酯纳米颗粒(10-90nm)。利用动态光散射(DLS)，原子力显微镜(AFM)，1H-NMR对其结构进行了表征。通过与疏水相互作用包埋了抗肿瘤药物阿霉素(CNPs/DOX)，载药量约为14％;利用2，2'-二硫二吡啶活化纳米颗粒内部未反应的巯基，成功地接上SN38。此外，通过将纳米颗粒内部的丙烯酸酯与半胱胺的反应转化为胺基，可以用荧光染料Cy7标记纳米颗粒，从而用于后文的体内试验。
　　第三章通过体外释放、体外细胞毒性实验、药物的亚细胞分布实验对不同尺寸的CNPs/DOX的体外活性进行了评价。酸敏感释放实验表明CNPs/DOX具有明显的pH敏感释放特性;随后以乳腺癌Bcap37细胞为肿瘤细胞模型，采用MTT法测定不同尺寸CNPs/DOX的体外细胞毒性，结果表明三种尺寸的CNPs/DOX均对Bcap37的生长具有良好的抑制作用，而CNPs本身具有很好的生物相容性;最后以BCap37细胞作为体外细胞模型，通过激光共聚焦显微镜(CLSM)来观察细胞对CNPs/DOX的摄取及胞内分布情况，结果显示CNPs/DOX能快速进入细胞，随着时间的延长CNPs/DOX能在溶酶体酸性环境中释放出游离DOX并进入细胞核。
　　第四章评价了三种尺寸的CNPs/DOX的体内分布、抑瘤与安全性。首先研究了不同尺寸的CNPs与血浆清除速率间的关系。结果表明与游离DOX相比，CNPs/DOX显著改善药物的药代动力学特征，且血液清除半衰期随着CNPs的尺寸增加而延长;此外，我们发现包埋药物的CNPs/DOX与键合的CNPs-Cy7显示出不同的血浆清除行为。体内分布实验显示CNPs/DOX能通过EPR效应明显在肿瘤部位富集，且尺寸越大富集能力越强，这与血浆清除实验的结果一致。CNPs/DOX体内抗肿瘤疗效理想，HE染色的结果表明与小分子阿霉素相比其毒副作用显著降低、安全性大大提高等优势。
　　第五章利用点击反应合成了不同代数的丁二胺为核的聚酯树枝状大分子，使用1H-NMR与GPC对其进行表征。随后用两种酸酐3，4，5，6-四氢苯酐(DCA)和丁二酸酐(SA)对其表面进行了改性，改性后的树枝状大分子具有良好的稳定性以及水溶性;研究了D4.5-DCA与G4.5-SA在不同pH条件下电势随时间的变化情况，以及不同pH条件下的溶血能力，结果表明在酸性条件下(pH5.0) D4.5-DCA具有良好的电荷翻转能力和溶血能力;最后通过与两嵌段聚乙二醇-聚赖氨酸(PEG-b-PLL)静电自组装形成稳定的纳米颗粒。调节PLL聚合度的不同，可以调控自组装纳米颗粒的尺寸。
　　第六章考察了G4.5-DCA包载阿霉素药物的能力并研究了与PEG-b-PLL静电自组装情况。考察了体外释放、体外细胞毒性实验、药物的亚细胞分布及血浆清除曲线。酸敏感释放实验表明PEG-b-PLL/G4.5-DCA(DOX)具有明显的pH敏感释放特性且表面的PEG-b-PLL能有效阻止其在生理条件下的药物突释;采用MTT法测定了PEG-b-PLL/G4.5-DCA(DOX)的体外细胞毒性，结果显示PEG-b-PLL/G4.5-DCA(DOX)对肿瘤细胞Bcap37和Hela的生长具有良好的抑制作用;通过CLSM来观察肿瘤细胞对PEG-b-PLL/G4.5-DCA(DOX)的摄取及胞内分布情况，结果表明PEG-b-PLL/G4.5-DCA(DOX)能将DOX输送到细胞核;血浆清除实验表明与游离DOX和G4.5-DCA(DOX)相比，纳米颗粒能显著改善药物的药代动力学性质。

目录

声明

致谢

摘要

缩略语表

第一章 文献综述

1．1 肿瘤及其治疗现状

1．2 纳米药物载体

1．2．1 肿瘤被动靶向

1．2．2 肿瘤主动靶向

1．3 纳米药物的分类

1．3．1 基于化学键合的药物输送(Polymer conjugates)

1．3．2 脂质体(Liposomes)

1．3．3 无机纳米颗粒(Inorganic nanoparticles)

1．3．4 树枝状分子(Dendrimers)

1．3．5 胶束(Micelles)

1．4 聚合物胶束的稳定性

1．4．1 双功能团的交联剂交联

1．4．2 自由基聚合交联

1．4．3 光引发交联

1．5 影响纳米药物的药代动力学及体内分布的因素

1．5．1 表面性质

1．5．2 尺寸

1．5．3 表面电荷

1．5．4 形貌

1．6 肿瘤细胞核靶向药物输送

1．6．1 核定位介导的核靶向药物输送及屏蔽策略

1．6．2 阳离子聚合物

1．7 论文的选题思路及主要研究内容

第二章 尺寸可控纳米颗粒的合成、表征及载药研究

2．1 材料和方法

2．1．1 药品及试剂

2．1．2 实验仪器

2．1．3 TLA-6SH的合成

2．1．4 聚乙二醇单丙烯酸酯的合成(mPEG-AC)

2．1．5 单体EGDA的合成

2．1．6 不同尺寸纳米颗粒(CNPs)的合成

2．1．7 SN38-SH的合成

2．1．8 CNPs-SN38的合成

2．1．9 CNPs-Cy7的合成

2．1．10 CNPs的稳定性考察

2．1．11 CNPs／DOX的制备与表征

2．1．12 DOX以及SN38紫外吸收与荧光标准曲线的绘制

2．2 结果与讨论

2．2．1 单体的核磁表征

2．2．2 标准曲线的建立

2．2．3 CNPs的粒径及分布

2．2．4 CNPs-SN38和CNPs-Cy7的合成及表征

2．2．5 CNPs的体外稳定性考察

2．2．6 CNPs／DOX的制备及表征

2．3 本章小结

第三章 CNPs／DOX的体外活性

3．1 材料和方法

3．1．1 药品及试剂

3．1．2 实验仪器

3．1．3 细胞培养

3．1．4 CNPs／DOX的体外药物释放

3．1．5 体外细胞毒性实验(MTT实验)

3．1．6 CNPs／DOX的亚细胞分布实验

3．2 结果与讨论

3．2．1 CNPs／DOX的体外药物释放研究

3．2．2 CNPs／DOX与游离DOX的亚细胞分布实验

3．2．3 CNPs／DOX体外细胞毒性实验

3．3 本章小结

第四章 CNPs／DOX的体内活性

4．1 材料和方法

4．1．1 实验材料

4．1．2 实验仪器

4．1．3 细胞培养及实验动物

4．1．4 ICR小鼠血浆清除实验

4．1．5 乳腺癌细胞BCap37荷瘤裸鼠模型的建立

4．1．6 CNPs／DOX的体内安全性及抗癌活性实验

4．1．7 CNPs／DOX的体内分布

4．1．8 移植瘤及心脏的组织病理学研究

4．2 结果与讨论

4．2．1 阿霉素的异丙醇溶液校正曲线

4．2．2 CNPs／DOX与CNPs-Cy7的血浆清除曲线

4．2．3 CNPs／DOX的体内分布

4．2．4 CNPs／DOX的体内抗肿瘤活性及安全性实验

4．2．5 CNPs／DOX肿瘤与心脏毒性的的组织病理学研究

4．3 本章小结

第五章 电荷翻转聚酯树枝状大分子的合成及其静电自组装研究

5．1 材料和方法

5．1．1 实验试剂

5．1．2 实验仪器

5．1．3 丁二胺为核的聚酯树枝状大分子的合成及表征

5．1．4 G4-5-DCA的合成

5．1．5 丁二胺为核的聚酯树枝状大分子的核磁和GPC表征

5．1．6 不同分子量PEG-b-PLL的合成

5．1．7 G4．5-DCA表面电势在不同pH下随时间变化曲线

5．1．8 G4．5-DCA在不同pH下的溶血实验

5．1．9 G4．5-DCA与PEG-b-PLL静电自组装形成纳米颗粒的制备及表征

5．1．10 纳米颗粒的粒径与zeta电位表征

5．1．11 纳米颗粒的稳定性研究

5．2 实验结果与讨论

5．2．1 丁二胺为核的树枝状大分子的合成与表征

5．2．2 G4．5-DCA的核磁表征

5．2．3 不同分子量PEG-b-PLL的合成

5．2．4 G4．5-DCA表面电势在不同pH下随时间变化曲线

5．2．5 不同pH条件下G4．5-DCA的溶血研究

5．2．6 G4．5-DCA与PEG-b-PLL静电自组装形成纳米颗粒的DLS表征

5．2．7 纳米颗粒的稳定性研究

5．3 本章小结

第六章 静电自组装体的载药及体内外实验

6．1 材料和方法

6．1．1 实验试剂

6．1．2 实验仪器

6．1．3 细胞培养

6．1．4 G4．5-DCA(DOx)的制备与表征

6．1．5 正负电荷比对纳米颗粒形成的影响

6．1．6 PEG-b-PLL／G4．5-DCA(DOX)的粒径分布，AFM与TEM表征

6．1．7 PEG-b-PLL50／G4．5-DCA纳米颗粒在酸性条件下的解离

6．1．8 阿霉素紫外吸收与荧光标准曲线的绘制

6．1．9 PEG-b-PLL／G4．5-DCA(DOX)与G4．5-DCA(DOX)的体外药物释放

6．1．10 体外细胞毒性实验(MTT实验)

6．1．11 PEG-b-PLL／G4．5-DCA(DOX)的亚细胞分布实验

6．1．12 小鼠血浆清除实验的给药和样品采集

6．2 结果与讨论

6．2．1 G4．5-DCA(DOX)的制备

6．2．2 正负电荷比对纳米颗粒形成的影响

6．2．3 PEG-b-PLL／G4．5-DCA(DOX)纳米颗粒的粒径及表征

6．2．4 PEG-b-PLL50／G4．5-DCA纳米颗粒在酸性条件下的解离

6．2．5 PEG-b-PLL50／G4．5-DCA(DOX)的体外释药研究

6．2．6 PEG-b-PLL／G4．5-DCA(DOX)的体外细胞毒性实验

6．2．7 PEG-b-PLL／G4．5-DCA(DOX)作用后肿瘤细胞形态的观察

6．2．8 PEG-b-PLL50／G4．5-DCA(DOX)的亚细胞分布实验

6．2．9 PEG-b-PLL／G4．5-DCA(DOX)的体内清除实验

6．3 本章小结

第七章 结论与展望

参考文献

作者简历及科研成果