胃癌单链抗体和免疫毒素scFv-TCS的制备和抗肿瘤作用研究

摘要

目的:
　　在本实验室已有抗胃癌单链抗体库的基础上，研究单链抗体的表达方法;通过基因融合技术，将单链抗体与天花粉蛋白连接构成免疫毒素scFv-TCS，通过基因表达获得重组免疫毒素，在培养细胞和小鼠移植肿瘤模型中，研究其抗肿瘤作用。
　　方法:
　　第一部分:单链抗体在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达
　　将scFv插入原核表达载体PET30a质粒，转入E.coli BL21(DE3)，37℃，1 mMIPTG诱导表达3h，离心收集菌体，超声破碎显示scFv以包涵体形式表达，在8M尿素变性环境下经Ni-NTA树脂纯化后逐级降低尿素浓度，最终透析至PBS中，得到可溶性scFv。将scFv插入真核表达载体pPIC9质粒，转入毕赤酵母GS115中，甲醇诱导表达120 h，得到scFv蛋白。
　　第二部分:免疫毒素scFv-TCS在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达
　　将scFv基因与天花粉蛋白(TCS)基因通过接头GGGGS融合，插入原核表达载体PET30a质粒，转入E.coli BL21(DE3)，30℃，1 mM IPTG诱导表达3h，离心收集菌体，超声破碎显示scIT以包涵体形式表达，在8M尿素变性环境下经Ni-NTA树脂纯化后逐级降低尿素浓度，最终透析至PBS中，得到可溶性scIT。将scIT插入真核表达载体pPIC9质粒，转入毕赤酵母GS115中，甲醇诱导表达120 h，得到scIT蛋白。
　　第三部分:体外和体内抗肿瘤作用研究
　　体外实验，用MTT法测定scFv和scIT对人胃低分化粘液腺癌MGC-803细胞和人正常胃上皮GES-1细胞的毒性。
　　体内试验，裸鼠皮下接种3×106人胃癌MGC-803细胞，成瘤率达100％，尾静脉注药scFv、scIT、TCS。
　　第四部分:抗HER2抗体对HER2高表达胃癌的检测
　　免疫新西兰兔获得抗HER2胞外区多克隆抗体，与HER2高表达人胃癌NCI-N87细胞检测结合力，对27位胃癌患者肿瘤切片进行免疫组化检测。
　　结果:
　　1.scFv蛋白在大肠杆菌中，37℃，1 mM IPTG诱导3h后超声破碎菌体，得到27kD的条带，显示以包涵体形式表达，经纯化透析复性后得到目的蛋白;在酵母系统中经过120 h甲醇诱导后以分泌蛋白形式表达，但表达量不高。
　　2.scIT蛋白在大肠杆菌中，30℃，1 mM IPTG诱导3h后超声破碎菌体，得到60 kD的条带，显示以包涵体形式表达，经纯化透析复性后得到目的蛋白;在酵母系统中经过120h甲醇诱导后以分泌蛋白形式表达，但表达量不高。
　　3.scFv、scIT在体外实验中，对MGC-803细胞具有毒性;体内实验显示scFv、scIT均具有抑制肿瘤生长作用。
　　4.抗HER2-ECD抗体可以特异性结合HER2高表达胃癌NCI-N87细胞，与HER2低表达胃癌MGC-803细胞不结合，对27侧胃癌患者的检测结果得到4例IHC阴性，7例IHC1+，11例IHC2+，5例IHC3+。
　　结论:
　　成功表达并纯化scFv和免疫毒素scFv-TCS蛋白，在裸鼠移植性人胃癌模型中显示对胃癌生长的抑制作用;获得具有高特异性的抗HER2抗体，可用于检测胃癌患者HER2表达水平。

目录

声明

致谢

摘要

缩略词表

1 绪论

2 胃癌单链抗体、免疫毒素表达及活性测定

2．1 前言

2．2 实验仪器和材料

2．3 实验方法

2．4 实验结果

2．5 结果讨论

3 抗HER2抗体对HER2高表达胃癌的检测

3．1 前言

3．2 实验仪器和材料

3．3 实验方法

3．4 实验结果

3．5 结果讨论

4 结论

参考文献

综述 针对HER2靶点的抗体药物设计与肿瘤靶向治疗

作者简历及在学期间所取得的科研成果