棉花农杆菌花粉管通道遗传转化方法的建立与转基因高油棉花种质的创造及其应用

摘要

棉花是重要的经济作物，它给人类提供了丰富的纺织原料。棉花种子中含有大量的脂肪和蛋白质成分，也是重要的油料作物之一。棉花遗传育种目标主要集中于提高棉花纤维的产量和品质，而对提高棉花主要副产品棉籽的含油量研究报道很少。开展高含油量棉花的育种，对减缓世界能源紧张和提高国民经济生产有重要意义。
　　本研究中，选用了克隆自斑鸠菊的二酰甘油酰基转移酶的其中一个基因VgDGAT1a，研究其对提高棉籽含油量的作用。同时，为提高田间筛选和收获的效率，选用了具有自主知识产权的抗草甘膦基因EPSPS-G6作为筛选基因，通过优化田间转化体系，创制同时含有高油基因和抗草甘膦基因的棉花新种系。主要研究结果如下:
　　1.以pCAMBIA1301为植物表达载体，构建了含高油基因VgDGAT1a的两个载体，pCAMBIA1301-VgDGAT1a和pCAMBIA1301-VgDGAT1a+EPSPS-G6，筛选基因分别为潮霉素抗性基因hyg和草甘膦抗性基因EPSPS-G6。
　　2.创制了农杆菌-花粉通道遗传转化方法，显著提高了遗传转化效率。以中棉所49号为受体材料，借助棉花授粉时产生的花粉管通道，用农杆菌侵染自花授粉的棉花柱头能够有效获得转基因植株，转化效率可达18％，为棉花基因工程和基因功能验证提供了一个优良的遗传转化方法和平台。该技术选择次日开放的棉花花蕾，用燕尾夹夹住花蕾自交;开花当天用农杆菌进行柱头侵染处理，并保持自交状态;收获的种子种于大棚内，真叶展开后根据外源基因的筛选标记进行田间筛选，获得转基因候选植株用PCR和Southern blot检测验证。农杆侵染处理时间以下午较好;草甘膦筛选浓度以20 mL/L较有效。
　　3.创制了抗草甘膦、高油的转基因种质系。通过本研究创制的遗传转化方法获得的转基因候选植株，经PCR检测，大多能够扩增出VgDGAT1a和EPSPS-G6基因条带。Southern blot结果表明，不同转基因植株间的外源基因的拷贝数为1～5个，说明这两个外源基因已经整合到棉花的基因组中。转基因植株均能开花结实。目前已获得了T2代转基因植株。对T1中获得的棉籽进行油分测定结果表明，转VgDGAT1a的棉籽的含量油从原来的27.9％增加到了38.8％，为棉花种子品质育种提供了优异的高油种质资源材料。

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致谢

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1．1 棉花遗传转化研究进展

1．1．1 常用的棉花遗传转化方法

1．1．2 常用的棉花遗传转化受体体系

1．2 棉花种子油分研究进展

1．2．1 棉籽油的形成及关键基因

1．2．2 棉籽油脂肪酸成分与营养价值

1．2．3 棉籽油脂肪酸合成过程

1．2．4 棉籽油形成过程中的相关基因

1．3 抗草甘膦基因及其应用

1．3．1 草甘膦性质

1．3．2 草甘膦作用机理

1．3．3 抗草甘膦基因工程及其应用

1．4 本研究目的与意义

第二章 植物表达载体的构建

2．1 材料与方法

2．1．1 试验材料

2．1．2 实验方法

2．2 结果与分析

2．2．1 VgDGAT1a基因和EPSPS-G6基因的PCR鉴定

2．2．2 载体pCAMBIA1301-VgDGAT1a的酶切鉴定

2．2．3 载体pCAMBIA1301-VgDGAT1a+EPSPS-G6的酶切鉴定

2．3 讨论

第三章 棉花农杆菌花粉管通道遗传转化方法的建立与高油种质创造

3．1 材料与方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验方法

3．2 结果与分析

3．2．1 草甘膦筛选浓度选择

3．2．2 最佳转化时间的选择

3．2．3 不同筛选标记差异

3．2．4 外源基因插入数量对转化的影响

3．2．5 PCR鉴定

3．2．6 Southern blot杂交鉴定

3．2．7 转基因高油棉花种质系的创造

3．3 讨论

第四章 棉花转基因技术体系操作规程及其转基因高油棉花种质系的应用前景

4．1 棉花转基因技术体系操作规程

4．2 转基因高油棉花种质系的应用前景

第五章 全文小结

参考文献