功能化超小顺磁性纳米铁颗粒(USPIO)的合成及其在小鼠胰岛细胞移植活体示踪的应用

摘要

近年来，超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPIO)或超小超顺磁性氧化铁纳米颗粒(USPIO)良好的生物相容性及多能性得到广大学者的普遍认同，被越来越多地应用于标记细胞或者肿瘤，尤其是在进行活体内无创监测示踪方面。但自从美国食品药品管理局(FDA)批准的第一批商用SPIO产品Feridex(@)和Resovist(@)分别在2008年和2009年底停产以来，一直未有一种合适的能够在临床应用的SPIO替代产品出现。在本研究中，我们研发了一种简便的、以无毒性的水合无机铁盐作为纳米材料铁核心的前体替代过往相对剧毒的乙酰丙酮铁的合成工艺。并在此基础上，进一步用两亲性聚合物——羧基化的聚氧乙烯月桂醚(OE-PEG-COOH)对油性环境下合成的铁核心进行包被，制备了具有良好水溶性的USPIO纳米颗粒，最后再用Bcl-2等单抗对其表面进行功能化。进一步实验证实，这种新型的纳米材料能够有效的被β细胞内吞，并在相对低铁浓度下对原代胰岛细胞进行有效标记。我们通过商用产品FeraSpin S对这种新型纳米材料进行了生物相容性以及细胞毒性的对比实验研究，并对其安全剂量范围进行了初步测定。进一步的结果证实，这种新型纳米材料能够有效地对体内的移植胰岛细胞进行标记示踪，并在临床3.0T MRI场强下清晰显影。后续的普鲁士蓝染色实验以及免疫组化实验亦对纳米材料能够有效标记体内胰岛细胞予以进一步证实。此外，值得一提的是，基于本合成路线，我们可以将末端Bcl-2功能化单抗替换成任意其他特异性的靶标分子，合成新型的其他特异性USPIO探针，提高标记特异性，例如Exendin-4-USPIO。以上结果均提示这种新型的功能化USPIO具有标记示踪胰岛细胞或其他细胞的良好应用前景。
　　第一部分 Bcl-2功能化USPIO的制备及其表征
　　目的:自行研制无毒性两亲性聚合物表面修饰的USPIO，修饰亲水末端基团进行Bcl-2单抗连接，并对制备的磁纳米颗粒的结构、形貌和理化性状进行表征。方法:油性条件下采用无毒水合铁盐作为前体制备USPIO铁核心，然后通过旋转蒸发法对其进行两亲性聚合物的包被增加水溶性。应用酸化氧化法对亲水端末端OH基团改性为COOH基团，后续应用NHS/EDC法与Bcl-2单抗相连制备功能化USPIO。并进一步对制备的USPIO、Bcl-2-USPIO通过等离子发射光谱(ICP)、透射电子显微镜(TEM)、纳米激光粒度仪(DLS)、振动样品磁强计(MPMS)和磁共振成像系统(MR scanner)等方法对其理化性状进行研究。
　　结果: USPIO呈黑褐色，长时间放置不产生团聚。TEM扫描提示USPIO颗粒核心直径约为4～10nm，分布集中，大小均一，性质稳定，分散性好。经两亲性聚合物包被后，纳米激光粒度仪分析结果提示整体粒径平均尺寸为28nm。C13质谱测试，证实两亲性聚合物的羟基端成功改性为羧基，在163ppm处出现明显峰值。制备的USPIO在室温(300K)外磁场为2T时的磁滞回线提示制备的USPIO的饱和磁化强度为38emu/g，与商用产品Feridex41 emu/g相当。MRI显示USPIO可以明显缩短T1和T2弛豫时间，T2信号强度与样品的Fe浓度正相关。
　　结论:成功制备出具有高分散性、强磁性、粒径均匀的USPIO，3.0-T MRI显示USPIO具备良好的超顺磁性。
　　第二部分 PEG-USPIO标记胰岛细胞系INS-1、beta-TC-6的细胞生物学研究
　　目的:研究自制的USPIO体外标记胰岛细胞系的效率、以及对细胞活力和功能的影响，为后续胰岛移植MRI活体示踪奠定基础。
　　方法:培养胰岛细胞系INS-1以及Beta-TC-6，使用USPIO分别标记。采用普鲁士兰染色和细胞内铁浓度测定等方法观察被标记细胞内铁颗粒情况。利用梯度浓度USPIO标记INS-1细胞，普鲁士兰染色检测其标记效率。采用四唑盐(MTT)比色试验检测USPIO标记的INS-1细胞活力。应用流式细胞仪荧光检测标记后细胞的凋亡水平。采用葡萄糖刺激胰岛素释放试验对标记后Beta-TC-6细胞的胰岛素分泌功能进行评估。
　　结果:细胞内铁染色:普鲁士蓝染色显示USPIO标记的INS-1细胞胞质内出现细小的蓝色铁颗粒。标记效率的检测:体外MRI扫描和普鲁士蓝染色提示，不同铁浓度USPIO和FeraSpin S分别标记2105 INS-1细胞24h，MRI扫描T2信号随标记铁浓度升高而降低，细胞质内的蓝色铁颗粒也相应增加。在相同铁浓度下作用24h，USPIO较FeraSpin S对INS-1细胞的标记效率更高。细胞形态学观察:倒置相差显微镜下USPIO标记组、FeraSpin S标记组和未标记组INS-1细胞之间，细胞形态无明显差异。USPIO对细胞活力的影响:MTT结果显示，USPIO和FeraSpinS在0-50μg Fe/mL浓度以下标记INS-1细胞24h，细胞活力在超过30μg Fe/mL浓度后逐渐降低。USPIO对细胞增殖的影响:USPIO和FeraSpin S以0-50μg Fe/mL浓度标记INS-1细胞24h，细胞生长能力在超过30μg Fe/mL浓度后逐渐降低。USPIO对细胞早期凋亡水平的影响:流式细胞仪检测显示，USPIO以0-50μg Fe/mL浓度标记INS-1细胞24h，细胞凋亡/死亡在超过30μg Fe/mL浓度后逐渐增加。USPIO对细胞功能的影响:葡萄糖刺激胰岛素释放试验结果显示，USPIO以0-50μg Fe/mL浓度标记24h，Beta-TC-6细胞胰岛素释放功能在超过30μg Fe/mL浓度后明显降低。
　　结论:制备的USPIO具有良好的生物相容性和超顺磁性，能够有效标记INS-1以及Beta-TC-6细胞，对细胞的活性和功能在未超过30μg Fe/mL浓度的情况下没有明显影响，在标记细胞的MRI体外扫描中表现出很强的磁信号。
　　第三部分 Bcl-2功能化USPIO标记小鼠原代胰岛细胞MRI活体不踪研究
　　目的:在体外应用USPIO对小鼠原代胰岛细胞进行标记，建立USPIO标记小鼠胰岛细胞同种异体肾包膜下移植模型，应用3.0-T临床磁共振成像系统动物线圈活体示踪USPIO标记小鼠胰岛细胞。
　　方法:将制备的USPIO，分别取0，1.25，2.5，5，10，20，30，40，60，80μg Fe/mL不同浓度，进行MRI体外扫描，观察信号变化。分离纯化150个C57BL/6小鼠胰岛，用制备的PEG-USPIO标记后，进行C57BL/6小鼠同种异体肾包膜下移植，术后第1，8，15，21d对移植物进行MRI活体示踪。将移植模型肾脏进行石蜡切片，胰岛素免疫组织化学染色和普鲁士蓝染色观察。
　　结果:通过USPIO以0，1.25，2.5，5，10，20，30，40，60，80μ Fe/mL浓度数量梯度的MRI体外扫描，确定MRI扫描的磁强回归线性参数。USPIO10和30μgFe/mL浓度标记的150个C57BL/6小鼠原代胰岛同种异体肾包膜下移植，MRI活体示踪可以观测到理想的磁信号，时间可以持续21d，MRI信号强度随移植后时间延长而逐渐减弱。移植模型肾石蜡切片行胰岛素免疫组化/普鲁士蓝双染色，证实肾包膜下USPIO标记的胰岛移植物存在及其被USPIO特异性标记。
　　结论:制备的USPIO可以有效标记小鼠胰岛细胞系INS-1及Beta-TC-6和原代胰岛，并通过3.0-T临床磁共振成像系统动物线圈进行同种异体肾包膜下移植MRI活体示踪。
　　第四部分 Exendin-4功能化USPIO靶向胰岛细胞MRI活体示踪研究
　　目的:尝试Exendin-4-USPIO对胰岛β细胞进行特异性标记，体外实验验证其标记有效性，体内应用3.0-T临床磁共振成像系统动物线圈活体示踪小鼠胰岛素瘤。方法:更换USPIO的靶向探针为exendin-4，常规体外验证其标记胰岛细胞有效性及细胞毒性。通过全身各器官病理切片及普鲁士蓝染色验证USPIO的体内分布情况。通过exendin-4与量子点的连接，荧光成像验证exendin-4的靶向性。构建INS-1种植瘤模型小鼠，通过尾静脉注入exendin-4-USPIO24小时后，进行MRI活体示踪。将移植模型肾脏进行石蜡切片，胰岛素免疫组织化学染色和普鲁士蓝染色观察验证USPIO标记情况。
　　结果:新制备的exendin-4-USPIO具有良好的生物相容性，未见明显细胞毒性。病理切片结果显示，无exendin-4修饰的USPIO积聚于肝、肾、脾、肺等组织，但并不积聚于胰腺的内、外分泌腺组织中;而exendin-4修饰的USPIO不仅在肝、脾等网状内皮系统中非特异性聚集外，还在胰腺中存在，并在胰岛中特异聚集。USPIO尾静脉注入负瘤小鼠体内24小时后，MRI活体示踪可以观测到胰岛素瘤体部位明显的磁信号。将瘤体行石蜡切片、胰岛素免疫组化/普鲁士蓝双染色，证实其被exendin-4-USPIO特异性标记。
　　结论:制备的exendin-4-USPIO可以有效标记小鼠胰岛细胞系和原代胰岛，并能够对小鼠胰岛素瘤进行MRI活体特异性示踪。

目录

声明

致谢

摘要

主要缩略语

引言

参考文献

第一部分 Bcl-2功能化USPIO的制备及其表征

引言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

参考文献

第二部分 PEG-USPIO标记胰岛细胞系INS-1、beta-TC-6的细胞生物学研究

引言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

参考文献

第三部分 Bcl-2功能化USPIO标记小鼠胰岛细胞MRI活体示踪研究

引言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

参考文献

第四部分 Exendin-4功能化USPIO靶向胰岛细胞MRI活体示踪研究

引言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

参考文献

全文总结

综述 超顺磁性氧化铁纳米颗粒合成制备及其在生物医学应用中的研究进展

作者简历及在学期间所取得的科研成果