不同消毒方法削减城市污水处理厂尾水中抗生素抗性基因的比较研究

摘要

近年来，水环境中抗生素的检出不断被报道，引起了公众“喝水等于吃药”的不安反应，直接触动了公众在水安全领域的敏感神经，同时抗生素和抗生素抗性基因(Antibiotic Resistance Gene，ARG)等新型污染物也逐步引起了广泛关注。抗生素抗性基因能在环境中持久性残留，并且可在不同环境介质中传播和扩散，因此抗生素抗性基因作为一种新型环境污染物已经成为环境学科领域的研究热点之一。污水处理系统中包含的抗生素、整合子、大量微生物等因素都可能会对抗生素抗性基因的形成、水平转移和扩增起到积极作用，因此污水处理厂被认为是抗生素抗性基因的一个重要储存库。
　　本研究对浙江省境内一家城市污水处理厂的二级出水和紫外消毒处理后出水进行采样，对尾水中的抗生素抗性基因（四环素类:tetA、tetM、 tetO、tetQ、tetW基因;磺胺类:sulⅠ、sulⅡ基因）的丰度进行调查，使用分子生物学手段进行四环素类和磺胺类抗性基因的定性定量研究，揭示紫外消毒处理对于抗性基因的作用;同时在实验室条件下对尾水进行紫外消毒、氯消毒、臭氧消毒小试试验，探究不同消毒方法在抗生素抗性基因削减过程中所起的作用，为实际应用提供理论依据和参考。结果表明:
　　(1)本研究选取的抗生素抗性基因，在不同季节的污水处理厂尾水中均有检出，sulⅠ检出丰度最高，tetW检出丰度最低。该污水处理厂的消毒工艺能够削减尾水中的抗生素抗性基因，削减的数量级在0.04～0.98之间，但尾水抗性基因丰度依然较高，仍然具有潜在的环境健康风险。
　　(2)紫外消毒处理过程中，随着紫外剂量的增加，抗生素抗性基因的丰度指数递减(R2=0.68～0.92)。经高剂量的紫外消毒，尾水中除tetQ外的四环素类抗性基因均能被去除至低于检测限，但磺胺类抗性基因sulⅠ并不能被有效去除，同时经紫外消毒处理后磺胺甲恶唑耐药菌的比例显著升高（紫外剂量20mJ/cm2时，耐药菌比例由29.43％上升至52.88％），磺胺类耐药菌具有UV耐受性可能是导致sulⅠ难以被有效去除的主要原因。在0～5mg/L有效氯浓度下，接触时间为30min的氯消毒处理过程中，抗生素抗性基因的丰度随着有效氯浓度的增加呈现线性递减(R2=0.77～0.99)。高浓度（5～50mg/L有效氯）的氯消毒处理，能基本去除磺胺类抗性基因，但难以完全去除四环素类抗性基因tetQ，同时低剂量的氯消毒处理后磺胺甲恶唑耐药菌比例显著降低，而四环素耐药菌比例有所提升，说明氯消毒能够有效去除磺胺类抗性基因及其耐药菌，氯消毒处理后仍存在的四环素耐药菌可能主要含有tetQ基因。臭氧消毒在浓度为2mg/L时，对于四环素类抗性基因的丰度均有较高的去除，但继续增加臭氧的浓度并未明显增强去除能力。
　　(3)氯消毒相比于其他两种消毒方法，更能有效的去除磺胺类抗性基因，在氯浓度为32mg/L时，去除率分别可达99.21和99.61％。经过紫外、氯、臭氧消毒处理，总可培养细菌、四环素耐药菌、磺胺甲恶唑耐药菌和多重耐药菌的数量均有所降低。其中臭氧的杀菌能力最强，当臭氧浓度为2mg/L时，可分别降低四环素耐药菌和磺胺甲恶唑耐药菌的浓度2.46、2.10个数量级。
　　(4)相关性分析表明，消毒处理过程中，部分抗性基因的丰度和相应耐药菌浓度存在一定的相关性(P＜0.05);微生物量的减少是消毒处理削减抗生素抗性基因的重要原因之一;Ⅰ类整合子基因intl1在污水处理厂的尾水中，与磺胺类抗性基因sulⅠ显著相关(R2=0.83，P＜0.01)，同时在3种消毒处理的进程中，包括sulⅠ在内的部分抗性基因也与Ⅰ类整合子表现出显著的相关性，表明Ⅰ类整合子在抗性基因的污染和转移过程中，扮演着重要的抗性基因载体角色。
　　(5)通过DNaseⅠ酶处理试验表明，紫外消毒和臭氧消毒处理后，细菌凋亡，菌体内的DNA释放，尾水中的抗生素抗性基因大多存在于这些游离态DNA中。因氯消毒的灭菌机制和紫外、臭氧消毒存在差异，氯消毒处理尾水后抗生素抗性基因仅部分存在于游离态DNA中。

目录

声明

致谢

前言

摘要

第一章 绪论

1．1 抗生素抗性基因概述

1．1．1 抗生素抗性基因的来源

1．1．2 抗生素抗性基因在细菌中的传播

1．2 研究现状

1．2．1 水环境中抗生素抗性基因与耐药菌的研究现状

1．2．2 污水处理厂削减抗生素耐药菌与抗性基因的研究现状

1．3 污水消毒工艺概述

1．3．1 氯消毒

1．3．2 紫外消毒

1．3．3 臭氧消毒

1．3．4 二氧化氯消毒

1．4 研究目标与内容

1．4．1 研究目标

1．4．2 研究内容

1．4．3 技术路线

第二章 实验材料和试验方法

2．1 实验材料与装置

2．1．1 试剂及试剂盒

2．1．2 常用溶剂和培养基配制

2．1．3 仪器和设备

2．2 样品的采集和处理

2．2．1 紫外消毒处理

2．2．2 氯消毒处理

2．2．3 臭氧消毒处理

2．3 抗性基因的测定

2．3．1 样品预处理方法

2．3．2 DNA的提取和鉴定

2．3．3 普通PCR及产物鉴定

2．3．4 标准曲线的建立

2．3．5 实时荧光定量PCR

2．4 耐药菌的分离培养和技术

2．4．1 培养基的配置

2．4．2 细菌培养和计数

第三章 污水处理厂尾水中抗性基因丰度研究

3．1 引言

3．2 实验材料与方法

3．2．1 样品采集

3．2．2 样品预处理和DNA提取

3．2．3 定量PCR试验

3．3 结果与讨论

3．3．1 污水处理厂尾水中抗生素抗性基因的检出

3．3．2 抗生素抗性基因与微生物总量的相关性

3．3．3 抗生素抗性基因与Ⅰ类整合子相关性分析

3．4 本章小结

第四章 消毒条件对于削减污水处理厂尾水中抗性基因的影响

4．1 引言

4．2 实验材料和方法

4．2．1 样品采集

4．2．2 样品处理

4．2．3 DNA提取和鉴定

4．2．4 抗性基因的检测与分析

4．3 结果与讨论

4．3．1 紫外光强度和照射时间对于抗生素抗性基因的影响

4．3．2 紫外消毒去除抗生素抗性基因所需的紫外剂量

4．3．3 氯消毒对于抗生素抗性基因的影响

4．3．4 消毒条件和削减抗生素抗性基因的关系

4．4 本章小结

第五章 不同消毒方法削减污水处理厂尾水中抗生素耐药茵和抗性基因的比较

5．1 引言

5．2 实验材料和方法

5．2．1 样品的采集

5．2．2 样品处理

5．2．3 细菌培养和计数

5．2．4 抗性基因的检测与结果分析

5．3 结果与讨论

5．3．1 不同消毒方法削减污水处理厂尾水中抗生素抗性基因的比较

5．3．2 不同消毒方法削减污水处理厂尾水中抗生素耐药菌的比较

5．3．3 耐药菌和抗性基因之间的相关性分析

5．3．4 抗性基因和16S rRNA基因之间的相关性分析

5．3．5 抗性基因和Ⅰ类整合子基因之间的相关性分析

5．4 本章小结

第六章 应用DNase Ⅰ对消毒处理削减水中抗性基因的机制初探

6．1 引言

6．2 实验材料与方法

6．2．1 样品采集

6．2．2 样品处理

6．2．3 细菌培养和计数

6．2．4 抗性基因的检测与分析

6．3 结果与讨论

6．3．1 DNase Ⅰ处理后抗生素耐药菌的浓度

6．3．2 DNase Ⅰ处理后抗生素抗性基因的丰度

6．3．3 消毒处理削减水中抗性基因的机制讨论

6．4 本章小结

第七章 结论与建议

7．1 结论

7．2 创新点

7．3 建议与展望

参考文献

个人简历

攻读学位期间发表的学术论文