杨梅主要过敏原分离纯化以及免疫活性鉴定

摘要

对于大多数人来讲，水果是一种健康食品，但有一部分人由于自身遗传以及生活环境等因素，对某一种或者多种水果过敏。这种现象伴随水果生产专业化以及销售网络全球化以及消费水果种类和数量的增加而更为普遍。水果过敏是患者的免疫系统发生紊乱而导致的，它主要是由于某些蛋白成分（过敏原）所引起的，一般属于Ⅰ型超敏反应（typeⅠ hypersensitivity），约1-3％的人群受到此类型疾病所困扰。因此，开展水果的过敏原研究对保护人们的生命健康、提高人民生活质量具有巨大的经济效益以及社会效益。本论文主要是从杨梅过敏原蛋白的分离纯化以及纯化产物的免疫学活性分析等方面进行研究，得到如下结论:
　　首先，应用Coca，s提取法提取杨梅果实中粗蛋白液，运用还原SDS-PAGE技术对杨梅粗提蛋白液进行初步分析，显示杨梅粗提蛋白中包含以前用过敏血清免疫印迹实验鉴定为28 kDa的主要过敏原蛋白条带。
　　其次，通过超滤离心法、SP-FF离子交换层析以及Superdex7510/300 GL凝胶柱层析方法分别纯化杨梅主要过敏蛋白。依据杨梅转录组推导的氨基酸数据，对杨梅主要过敏蛋白进行肽段指纹图谱、分子量质谱测定以及酶联免疫(ELISA)间接法分析与鉴定，得到杨梅主要过敏原理论分子量和质谱检测所得分子量一致，ELISA检测后有很强的免疫活性，且肽段指纹图谱匹配实验与氨基酸序列比对得出杨梅主要过敏蛋白属于几丁质酶第三家族(classⅢ chitinase)(已提交至NCBI数据库，序列号:KP307670)。
　　本研究初步对杨梅主要过敏原进行分离纯化以及免疫活性的鉴定分析，可在ELISA检测中作为杨梅特异性过敏原，为杨梅过敏反应疾病的诊断奠定了良好的基础。

目录

声明

致谢

摘要

缩略语表

1 绪论

1．1 水果过敏及水果过敏原

1．1．1 水果过敏的背景知识

1．1．2 过敏的定义及症状

1．1．3 过敏反应免疫学发生机理

1．1．4 水果过敏的流行病学调查与研究现状分析

1．1．5 过敏原鉴定与命名

1．1．6 主要水果过敏蛋白家族分类和特性

1．2 过敏原分离纯化和分子研究进展

1．2．1 过敏原分离纯化研究进展

1．2．2 过敏原分子研究进展

1．3 杨梅过敏原的研究概况

1．4 本论文研究意义

1．5 本实验的研究内容和技术路线

2 杨梅果实蛋白提取、过敏蛋白质鉴定

2．1 材料与方法

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验仪器和试剂配制

2．1．3 实验杨梅过敏蛋白粗提取液的制备

2．1．4 杨梅粗蛋白浓度的测定

2．1．5 杨梅粗蛋白与杨梅患者血清IgE结合活性测定

2．1．6 杨梅粗蛋白SDS-PAGE电泳

2．1．7 杨梅过敏原蛋白质鉴定分析

2．1．8 杨梅过敏原蛋白分子克隆

2．1．9 杨梅过敏蛋白氨基酸序列分析

2．2 结果与分析

2．2．1 杨梅粗蛋白浓度测定

2．2．2 杨梅粗蛋白ELISA实验

2．2．3 杨梅粗蛋白SDS-PAGE

2．2．4 杨梅过敏原蛋白质鉴定

2．2．5 杨梅过敏原蛋白分子克隆鉴定

2．2．6 杨梅过敏原蛋白氨基酸序列同源性分析

2．3 讨论

2．3．1 蛋白提取液的选择

2．3．2 杨梅提取物免疫活性

2．3．3 杨梅过敏蛋白氨基酸序列同源性分析

2．4 本章小结

3 杨梅天然过敏蛋白几丁质酶组分纯化及免疫学鉴定

3．1 材料和方法

3．1．1 实验仪器与材料

3．1．2 主要试剂配制

3．1．3 杨梅粗提蛋白超滤浓缩以及蛋白缓冲液的更换

3．1．4 杨梅粗提蛋白的冷冻干燥

3．1．5 离子交换层析纯化杨梅过敏蛋白

3．1．6 分子筛进一步纯化杨梅过敏蛋白

3．1．7 杨梅天然过敏蛋白分子量鉴定

3．1．8 杨梅天然过敏蛋白的免疫学活性分析

3．2 结果与分析

3．2．1 杨梅天然过敏蛋白的离子交换层析

3．2．2 杨梅天然过敏蛋白的Superdex 75 10／300 GL凝胶柱层析

3．2．3 纯化后的杨梅天然过敏蛋白分子量鉴定

3．2．4 纯化后的杨梅天然过敏蛋白酶联免疫检测

3．3 讨论

3．3．1 杨梅天然过敏蛋白离子交换的选择

3．3．2 Superdex 75 10／300GL凝肢层析进一步纯化杨梅天然过敏蛋白

3．3．3 杨梅天然过敏蛋白ELISA酶联免疫实验

3．4 本章小结

4 结论与展望

参考文献