结直肠癌细胞与微环境相互作用诱导上皮间质转化过程中差异表达基因的筛选及初步鉴定

摘要

根据美国癌症协会的统计数据，每年美国死亡人口中每四人有一人死于癌症，全球数据也显示，恶性肿瘤的发病率及死亡率不断升高，成为降低人类生存质量、威胁人类健康的首要因素。决定癌症病人生存和预后的关键因素为远处转移和治疗耐药，但转移和耐药的确切机制并不完全清楚。近年来的研究提示，上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程发挥重要的作用。
　　EMT是上皮细胞受到自身及外界环境影响，逐渐失去上皮表型，向间质细胞形态转变的过程，包括细胞失去上皮极性;E-cadherin(CDH1)，occludin(OCLN)等上皮标志物表达水平降低;N-cadherin(CDH2)，vimentin(VIM)，fibronectin(FN1)等间质标志物表达升高;细胞间连接减少;细胞获得迁移和侵袭能力等等。发生EMT的肿瘤细胞同时获得了一定的干性(stemness)特征，有利于肿瘤细胞发生远处转移及抵抗化疗药物细胞毒性。EMT的发生机制非常复杂，多种分子和信号通路参与了EMT的发生。EMT的发生也受到肿瘤微环境中各种间质细胞及成分的调控。
　　肿瘤芽是位于肿瘤浸润前缘的单个肿瘤细胞或者细胞数量小于5个的肿瘤细胞团。肿瘤芽多少与病人的预后有关，数量多预后差。肿瘤芽是EMT在实体瘤内的形态学表现。因此肿瘤芽是研究人体肿瘤细胞与间质微环境相互作用的理想模型。本课题的目的是筛选和鉴定肿瘤细胞及其微环境相互作用诱导EMT过程中的差异基因，为阐明EMT形成机制提供基础。该研究分以下4个部分。
　　1.结直肠癌细胞及其微环境中EMT差异表达基因的筛选
　　我们选取新鲜结直肠癌手术标本，经过病理切片初筛之后，利用激光捕获显微微切割技术精确分离结直肠癌浸润前缘单个肿瘤芽细胞及芽周间质成分，利用表达谱芯片筛选EMT差异表达基因。通过t-test统计分析方法筛选肿瘤芽中差异表达基因(P＜0.05;fold change≥2或≤0.5)。
　　结果：显示，肿瘤芽中有494个差异表达基因，其中表达上调基因432个，表达下调基因62个。我们先基于文献中EMT相关调控因子数据构建EMT调控网络，利用皮尔森相关系数计算494个差异基因与已知EMT调控因子的相关性，而后根据蛋白质-蛋白质相互作用网络将肿瘤芽中494个差异表达基因富集到已构建好的EMT调控网络中，得到49个与已知EMT调控因子有蛋白质相互作用的基因。
　　以肿瘤芽间质成分为实验组，中心癌细胞间质及正常肠上皮细胞间质成分为对照组，筛选肿瘤芽间质微环境中差异表达基因(筛选标准为fold change≥2或≤0.5)。
　　结果：显示，肿瘤芽间质中有3495个差异表达基因。对这些差异基因进行分析，同样我们利用皮尔森相关系数计算差异基因两两之间的相关性、根据蛋白质-蛋白质相互作用数据将肿瘤芽间质中3495个差异基因富集到已构建好的EMT调控网络中，得到66个与已知EMT标志物有关联的基因。
　　为了进一步探索EMT调控机制，筛选EMT发生发展过程中的关键调控因子，我们对表达谱芯片数据进行了深入的数据挖掘。将正常、中心癌细胞、肿瘤芽作为肿瘤发生发展过程中的3个阶段，分别构建每个阶段的转录调控网络。利用构建好的正常肠上皮细胞、中心癌细胞以及肿瘤芽三个阶段的共表达网络，取3个阶段中基因-基因两两比较的差异基因的并集，将这些基因分别对应到正常、中心癌细胞、肿瘤芽3个阶段的基因表达值，计算每个阶段中基因与基因之间的相关系数，然后计算出基因覆盖拓扑关系(topological overlap)。利用平均链接层次聚类方法(average linkage hierarchical clustering)基于topological overlap得到不同的基因簇，即表达模式相似的基因。比较三个阶段的基因簇，找出肿瘤芽中特有的5个基因簇(PC1_var＞0.90，density＞0.7)。每个基因簇中的基因作为候选基因进行验证。
　　为了深入探究EMT发生过程中各路调控因子，我们将肿瘤芽中差异表达基因进行功能注释，从中筛选出EMT发生过程中炎症、表观遗传、代谢调控相关基因，以及EMT相关调控肿瘤细胞干性形成和肿瘤耐药基因。将这五个方面的差异基因基于KEGG数据库进行搜索，利用KEGG数据库中的基因-基因相互作用关系，构建差异基因间相互作用网络。其中，筛选到炎症相关基因56个;表观遗传相关调控基因80个;代谢相关基因95个;肿瘤细胞干性相关基因87个;肿瘤耐药相关基因17个。
　　2.筛选得到差异表达基因在结直肠癌组织中的初步验证
　　我们利用Nanostring nCounter system针对以上表达谱芯片筛选得到的差异表达基因进行初步验证，明确筛选结果的可靠性。具体过程是，显微微切割精确分离单个肿瘤芽及其周围间质成分，获得RNA后，进行Nugen线性扩增。cDNA产物进行nCounter检测。根据第一步差异表达基因的系统性生物信息学分析，我们筛选出268个基因进行验证，包括从肿瘤芽及其间质成分中筛选出的202个基因，以及66个文献已经开展研究、并认为参与EMT调控的EMT标志物（设计上作为一种对照）进行检测。候选基因在肿瘤芽中的验证一致性为82％(220/268)，在肿瘤芽间质中的验证一致性为83％(222/268)。对肿瘤芽及其间质中验证一致的基因根据表达差异倍数(ratio)进行筛选，共得到106个基因(ratio＞2&＜-2)。在这些基因中，18个基因在肿瘤芽及其间质中均有表达差异，IL6，GAB1，VANGL1在肿瘤芽及其间质中表达均上调，揭示了此18个基因可能在肿瘤芽及其微环境对EMT的交叉调控中发挥重要作用。
　　我们将nCounter验证一致的106个来自于肿瘤芽及其间质成分的基因进行EMT调控网络构建，基于KEGG数据库及蛋白质相互作用网络构建了肿瘤芽-微环境调控网络，系统分析了EMT发生发展过程中基因的交叉调控作用。我们发现：肿瘤芽中的差异表达基因CAV1/2,ITGA，TCF/LEF,KIT;肿瘤芽间质中的差异表达基因PTPRM，SMURF2,SMAD4,RUNX1T1，SRC,GRB;以及肿瘤芽及其间质微环境中共有的差异表达基因PTPRF,FUS，DCN，LTBP1，INHBA，SMAD2/3，ARHGAP5，IL6,PARD6A，WAS,ITGB,ROHA，MET,IGF2,KRAS,MMP1富集在EMT调控网络中，揭示了通过这些差异基因发挥作用的信号通路在肿瘤细胞及其微环境中发挥重要的交叉调控作用。这些基因功能的深入研究对阐明EMT的机制提供了新的思路和潜在药物作用靶点。
　　为了进一步分析nCounter技术初步验证得到的106个差异基因与肿瘤药物靶向结合的可能性，我们选择了131个肿瘤药物用来进行基因-药物靶向结合分析。我们对基因及肿瘤药物进行了富集分析，利用超几何分布检验对得到的基因与肿瘤药物靶向结合进行检验;对于基因与肿瘤药物靶向结合事件小于5的，采用fisher精确检验。我们发现：与肿瘤药物GSK269962A有靶向结合作用的基因有ACTA2，BGN,EHD2,FN1,LGALS1,THBS2,IGFBP7,MMP2,OLFML3(P＜0.0001);与肿瘤药物阿西替尼（Axitinib）有靶向结合作用的基因有BGN，CDH1，CLCA1，TBXA2R，MET,PDGFRA(P=0.017);与肿瘤药物尼洛替尼(Nilotinib)有靶向结合作用的基因为MEF2C，TBXA2R(P=0.036)。
　　3.潜在EMT标志物在结直肠癌细胞系中的验证
　　为了进一步验证肿瘤芽及其间质中筛选出的潜在标志物，我们基于nCounter技术在结直肠癌组织中的初步验证结果选择在肿瘤芽及其间质微环境中均有表达差异、且差异倍数较大的基因LGALS1及MMPs家族成员MMP1作为候选基因进行细胞系中的验证。利用经典EMT诱导因子TGFβ和TNFα诱导结直肠癌细胞系HT29和SW480发生EMT。我们发现MMP1和LGALS1在发生了EMT的两株结直肠癌细胞系中表达升高，揭示MMP1和LGALS1在结直肠癌细胞EMT发生过程中可能发挥重要调控作用。
　　4.潜在EMT标志物在结直肠癌组织中与经典EMT标志物的关系分析及预后分析
　　为了探究候选基因LGALS1，MMP1与肿瘤细胞发生EMT的相关性，我们利用7例病人来源的结直肠癌组织浸润前缘的肿瘤芽（实体瘤内EMT的形态学表现）基因表达数据分析了候选基因与经典EMT标志物CDH1，CDH2,VIM,SNAI1，TWIST1，以及ZEB1的表达相关性。我们发现：LGALS1与ZEB1具有很强的正相关性，且在肿瘤芽中表达趋势一致(r=0.821;P=0.023);MMP1与CDH2具有很强的正相关性，且在肿瘤芽中表达趋势一致(r=0.891;P=0.007);此外，LGALS1与CDH1具有比较强的表达负相关性（r=-0.536）、与SNAI1(r=0.607)，TWIST1(r=0.523)，VIM(r=0.571)有较强的表达正相关性。MMP1与TWIST1具有较强的正相关性(r=0.555)。
　　根据LGALS1，MMP1在结直肠癌组织样本中的检测结果，我们去掉每个基因对应的样本中有缺失值的项。最终留取83例样本进行MMP1的预后分析;82例样本进行LGALS1的预后分析。与正常对照组相比，LGALS1，MMP1在结直肠癌组织中的表达水平升高(P＜0.05)。并利用临床资料分别分析LGALS1，MMP1与结直肠癌患者生存预后的相关性。我们发现，LGALS1(P=0.032)和MMP1(P=0.006)均是结直肠癌患者预后指标(LGALS1和MMP1高表达结直肠癌患者预后差)。
　　综合上述研究结果，我们得出以下结论：(1)通过新鲜结直肠癌组织肿瘤芽显微切割、表达谱芯片分析、系统性生物信息学数据挖掘及结直肠癌组织中的初步验证，我们在肿瘤芽及其间质微环境中筛选到106个潜在EMT标志物;通过构建106个差异基因的EMT调控网络，我们分析了肿瘤细胞及其间质微环境对EMT的协同调控作用;并分析和预测了15个潜在EMT标志物与3种肿瘤药物的靶向结合作用。这是国际上首次利用病人来源的结直肠癌标本研究癌细胞与间质微环境相互作用调控EMT，所取得的大量数据为深入研究EMT的调控机制提供了基础。(2)在结直肠癌细胞系中的验证发现，MMP1和LGALS1在发生EMT的结直肠癌细胞系中表达升高，揭示候选基因与结直肠癌EMT的发生具有相关性。(3)利用结肠癌组织进行候选基因与经典EMT标志物的关系分析，我们发现LGALS1和MMP1分别与多个经典EMT标志物有表达相关性，提示这两个基因参与结直肠癌EMT过程的调控。且LGALS1和MMP1均是结直肠癌患者的预后指标，LGALS1和MMP1高表达结直肠癌患者预后差。再者，LGALS1与肿瘤药物GSK269962A有潜在靶向结合，我们推测LGALS1可能会是肿瘤治疗的潜在靶点。

目录

声明

致谢

摘要

缩略语

1 引言

2 主要的仪器设备和试剂

2．1 仪器设备

2．2 主要化学试剂

2．3 所用溶液配制

3 材料和方法

3．1 实验材料

3．2 实验方法

4 结果

4．1 结直肠癌细胞及其微环境中EMT差异表达基因的筛选

4．2 正常肠上皮、中心癌细胞、肿瘤芽基因簇挖掘

4．3 肿瘤芽及其间质微环境中EMT相关炎症因子、表观调控因子、代谢、肿瘤细胞干性及肿瘤耐药基因挖掘

4．4 筛选得到差异表达基因在结直肠癌组织中的初步验证

4．5 潜在EMT标志物在结直肠癌细胞系中的验证

4．6 潜在EMT标志物与经典EMT标志物相关性分析及预后分析

5 讨论

6 结论

参考文献

综述

作者简历及在读期间所取得科研成果及奖励