HIV感染者/艾滋病患者micrRNAs表达谱分析及其影响HIV感染的机制研究

摘要

HIV在复制过程中与宿主分子发生相互作用，其中一种重要的宿主分子是microRNA。microRNA是一类成熟体长度在19-22个核苷酸的非编码RNA，在人体的多种生理和病理过程中发挥重要作用。已有的研究证据显示microRNA和HIV之间存在相互影响，microRNA在HIV感染和疾病进展过程中都起了重要作用。一方面HIV感染影响细胞中microRNA的表达谱，另一方面细胞中高表达抗HIV的microRNA不利于HIV在细胞中的复制而有利于病毒潜伏状态的形成和维持。研究显示细胞和体液中microRNA表达状态与HIV感染严重程度和进展有相关性。综合上述研究证据，可以看到microRNA在HIV感染领域作为一种干预手段和生物标记物的前景。
　　ART（antiretroviral therapy）的应用在分子层面改变了细胞内环境，影响了HIV与宿主细胞的相互作用过程。已有证据表明ART可以使体内多种组织的mRNA表达谱及线粒体DNA表达状态发生改变，这些改变与HIV感染的病理变化和疾病进展相关。目前有关ART对microRNA表达谱影响的研究较少，也较少有研究涉及HIV感染过程中microRNA和mRNA表达的关联分析，尤其是与ART相关的microRNA和mRNA关联分析。我们尝试在分析HIV感染者、ART患者及正常对照人群之间PBMC中microRNA表达谱的基础上，在病毒感染模型中进行microRNA影响HIV复制的功能实验，同时对microRNA和mRNA表达谱数据进行关联分析，以期发现一些可能影响HIV复制过程的关键microRNA或者蛋白分子。
　　在本研究第一部分中，我们首先利用基因芯片技术分析HIV感染者（3例）、ART患者（3例）和正常对照(2例)PBMC中microRNA表达状况，发现microRNA表达谱在三组间存在差异，总体来说HIV阳性患者（包括HIV感染者和ART患者）PBMC中microRNA的表达呈下调趋势，数据显示表达量在三组间存在显著差异(P＜0.05)的microRNA共有11条;扩大样本量（总样本72例，HIV感染者、ART患者和正常对照组各24例），定量PCR验证临床来源PBMC样本，得到一条microRNA（hsa-miR-191-5p）在上述三组人群中存在显著差异(P＜0.05)，并且PBMC中hsa-miR-191-5p表达趋势与芯片数据吻合，HIV感染者PBMC中表达水平最低，ART患者PBMC中表达水平有升高，正常对照人群PBMC中表达水平最高。
　　在研究的第二部分中，体外模型实验证实hsa-miR-191-5p对HIV的复制有抑制效应。我们构建了含有hsa-miR-191前体序列的过表达的载体，并使用hsa-miR-191-5p的模拟物（mimic）在“293T/pNLA-3-dE-GFP/pVSV-G”HIV假病毒模型和“TZM-bl/HIV IIIB”HIV感染模型中过表达hsa-miR-191-5p，实验结果显示在上述两个细胞模型中hsa-miR-191-5p表现出对HIV复制的抑制效应，并且hsa-miR-191-5p可能是通过影响HIV复制过程中的关键分子间接影响了HIV的复制。
　　在研究的第三部分，我们对hsa-miR-191-5p影响HIV复制的机制做了探索。利用microRNA研究相关生物信息学数据库收集已有实验证实的hsa-miR-191-5p靶分子，检索miR-191相关文献作为数据库检索的补充，同时利用与本研究分组相同的PBMC中mRNA表达谱数据和本研究中得到的miRNA表达谱数据进行连锁分析预测hsa-miR-191-5p的潜在靶分子，之后在NCBI提供的HIV-1和人类蛋白相互作用数据库中对上述过程得到的hsa-miR-191-5p的靶分子或潜在靶分子进一步筛查，得到与HIV相关的靶分子。在上述筛选的基础上通过定量PCR和构建3'UTR报告基因载体的方法对hsa-miR-191-5p潜在靶标进行验证，实验结果表明CCR1和NUP50两个分子是hsa-miR-191-5p的靶分子，hsa-miR-191-5p可能是通过这两个分子影响了HIV的复制过程。
　　综上所述，本研究得到以下几个结论:
　　(1) microRNA表达谱在HIV感染和正常对照人群PBMC中存在显著差异，PBMC中microRNA的表达在HIV感染状态下总体呈下调趋势;
　　(2) hsa-miR-191-5p的表达水平在HIV感染者和正常对照人群PBMC中差异显著，体外实验显示hsa-miR-191-5p对HIV复制过程有抑制效应;
　　(3) qPCR和3'UTR报告基因实验显示CCR1和NUP50是hsa-miR-191-5p的靶分子，hsa-miR-191-5p可能是通过这两个分子影响了HIV的复制过程。

目录

声明

致谢

摘要

缩略词表

第一章 绪论

1 miRNA与HIV之间的相互作用

2 miRNA在HIV感染细胞中的表达谱

3 miRNA在HIV感染中作为治疗手段和生物标记物的可能性

4 问题的提出及解决思路

第二章 HIV感染相关miRNA表达谱分析及qPCR验证

1 引言

2 材料和方法

3 实验结果

4 讨论

5 结论

第三章 hsa-miR-191-5p对HIV感染的影响研究

1 引言

2 材料和方法

3 实验结果

4 讨论

5 结论

第四章 hsa-miR-191-5p影响HIV感染的机制研究

1 引言

2 材料和方法

3 实验结果

4 讨论

5 结论

参考文献

综述

作者简历及在学期间所取得的科研成果