利用半理性和理性策略对酶活性及手性选择性的设计

摘要

由于对映异构体之间理化性质和生理活性存在差异，手性化合物单体的光学纯度是生物医药、精细化工和材料科学等诸多行业的重要标准之一。以酶介导的手性化合物的合成法，具有立体选择性性高、反应条件温和等优点，是相关领域的研究热点。而酶的活性和手性选择性作为这种方法的关键因素，决定了该方法的效率和产品的光学纯度。因此，有必要对酶的活性和手性选择性进行优化，以拓展其在手性化合物合成中的应用。酶工程可以从分子水平上调控酶与底物的相互作用，是一种行之有效的优化酶催化性质的方法。本研究通过半理性和理性的酶工程策略，以在手性化合物合成中应用广泛的酯酶和脱氢酶为研究对象，对它们的活性和手性选择性进行设计优化。
　　首先，在前期对酯酶RspE在扁桃酸甲酯拆分中的手性选择性的定向进化中，发现手性选择性最优的第四轮突变体CVH（E30.8，比活力24μmolmin-1mg-1）的活性大大低于第二轮突变体YH（E8.7，比活力142μmolmin-1mg-1），出现了活性与手性选择性负相关变化的现象。本研究针对这一现象，采用结构分析与定点饱和突变相结合的半理性策略，经过筛选得到了活性与手性选择性同时保持高水平的突变体HMVY（E36.8，比活力113μmolmin-1mg-1），其手性选择性高于CVH并且活性与YH相当，实现了上述负相关现象的平衡。反应动力学分析表明，这种活性和手性选择性负相关现象的产生和被平衡是由于提高手性选择性所采取的途径不同造成的。突变体CVH通过大幅度抑制非偏好型底物的催化效率提高手性选择性，因而降低了拆分反应的活力;而突变体HMVY则通过特异性提高偏好型底物的催化效率，在提高手性选择性的同时保持了拆分反应的速率。分子模拟结果验证了反应动力学分析的结果。同时，对突变点氨基酸的分析表明，HMVY中的组氨酸增强了对偏好型底物催化基团的稳定作用，同时缬氨酸和酪氨酸的协同配合改变了偏好型底物的结合位置和方式，优化了其结合构象。
　　其后，利用理性设计策略，对酯酶BioH在潜手性3-苯基戊二酸二甲酯的不对称水解中的手性选择性进行设计。蛋白-底物复合物的结构分析表明，底物中的三位取代基在蛋白活性位点中的朝向是决定蛋白手性选择性的关键因素。基于这一假设，利用定点突变在蛋白活性口袋中引入与潜在S型底物的苯环产生特异性π-π堆叠作用的芳香族氨基酸，得到了手性选择性显著提高的突变体L86F，产物S-3-苯基戊二酸单酯的光学纯度由25％(WT)提高到了93％(L86F)。
　　为了进一步证明以上理性设计策略的有效性和普适性，以酯酶RspE为研究对象，运用同样的思路，对其在潜手性3-苯基戊二酸二甲酯的不对称水解中的手性选择性进行设计。通过引入芳香氨基酸残基，使产物3-苯基戊二酸单酯的光学纯度由野生型的13％(S)提高到突变体Y27R的99％(S)，同时在不同位点引入该作用还得到了手性选择性反转的突变体M121F（50％，R）。这一结果不仅证明了该策略的有效性，可以分别得到S和R型的手性选择性;同时还验证了上述理性设计策略的普适性，可以适用于活性口袋不用的蛋白。
　　此外，本研究还通过理性设计，对D-扁桃酸脱氢酶在R-邻氯扁桃酸的氧化中的活性进行优化。将关键位点的丙氨酸替换为组氨酸，尝试在蛋白和卤代底物之间引入卤键作用，以稳定蛋白底物复合物。最终得到的突变体A89H对R-邻氯扁桃酸的活性是野生型的5倍。
　　本研究通过半理性和理性的酶工程策略，实现了对酯酶BioH、酯酶RspE和D-扁桃酸脱氢酶的活性与手性选择性的设计，有助于其在手性化合物的合成中的应用。

目录

声明

致谢

摘要

1 绪论

1．1 手性化合物及其合成

1．1．1 手性化合物

1．1．2 手性化合物的应用

1．1．3 手性化合物的合成

1．2 酶的手性选择性及其改造

1．2．1 酶的手性选择性

1．2．2 酶工程

1．2．3 手性选择性的改造

1．3 分子模拟

1．3．1 分子模拟简介

1．3．2 常用的分子模拟方法

1．4 酯酶和脱氢酶及其在手性化合物合成中的应用

1．4．1 酯酶

1．4．2 脱氢酶

1．5 本文研究的主要内容

2 利用半理性设计平衡酯酶RspE定向进化中的活性与手性选择性的负相关变化

2．1 实验材料

2．1．1 菌株与质粒

2．1．2 工具酶

2．1．3 试剂

2．1．4 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 分子对接及结构分析

2．2．2 突变体库的构建

2．2．3 突变体库的筛选

2．2．4 优势突变体的活性测定

2．2．5 代表突变体的动力学常数测定

2．3 结果与讨论

2．3．1 结构分析及突变点选定

2．3．2 突变体库的筛选

2．3．3 代表突变体动力学常数的测定

2．3．4 活性选择性负相关现象产生与被平衡的酶反应动力学原因

2．3．5 活性选择性负相关现象产生与被平衡的蛋白工程方法学原因

2．4 小结

3 酯酶RspE活性手性选择性负相关变化现象的分子模拟

3．1 实验方法

3．1．1 蛋白分子结构及突变体构建

3．1．2 底物分子结构及力场参数确定

3．1．3 蛋白-底物复合物的构建

3．1．4 分子动力学模拟

3．1．5 模拟结果分析

3．2 结果与讨论

3．2．1 模拟体系平衡情况分析

3．2．2 反应过渡态有效性分析

3．2．3 功能基组原子的势能分析

3．2．4 口袋基组氨基酸与底物的相互作用能分析

3．2．5 蛋白-小分子复合物的构象分析

3．2．6 突变热点氨基酸对蛋白-底物相互作用的贡献分析

3．2．7 活性与手性选择性负相关变化现象产生与被平衡的分子机理

3．3 本章小结

4 酯酶BioH在对称二酯的不对称水解中的手性选择性的设计

4．1 实验材料

4．1．1 菌株与质粒

4．1．2 酶和试剂

4．1．3 主要仪器

4．2 实验方法

4．2．1 3-苯基戊二酸二甲酯的合成

4．2．2 BioH的克隆及突变体的构建

4．2．3 蛋白表达与纯化

4．2．4 蛋白纯度表征及浓度测定

4．2．5 3-苯基戊二酸二甲酯的不对称水解

4．2．6 酯酶BioH对3-苯基戊二酸二甲酯的不对称水解及产物表征

4．2．7 分子动力学模拟

4．3 结果与讨论

4．3．1 酯酶BioH野生型对3-苯基戊二酸二甲酯的不对称水解

4．3．2 野生型BioH与底物的结合分析

4．3．3 突变体设计

4．3．4 酯酶BioH突变体对3-苯基戊二酸二甲酯的不对称水解

4．3．5 蛋白-底物复合物的分子模拟

4．4 本章小结

5 酯酶RspE在对称二酯的不对称水解中的手性选择性的设计

5．1 实验材料与方法

5．2 结果与讨论

5．2．1 酯酶RspE野生型对3-苯基戊二酸二甲酯的不对称水解

5．2．2 酯酶RspE野生型与底物的结合分析

5．2．3 突变体设计

5．2．4 酯酶RspE突变体对3-苯基戊二酸二甲酯的不对称水解

5．2．5 蛋白-底物复合物的分子模拟

5．2．6 酯酶在对称二酯不对称水解反应中手性选择性的来源

5．2．7 手性选择性设计策略讨论

5．3 本章小结

6 D-扁桃酸脱氢酶DMdh对邻氯扁桃酸的活性的设计

6．1 实验材料

6．1．1 菌株与质粒

6．1．2 酶和试剂

6．1．3 主要仪器

6．2 实验方法

6．2．1 D-扁桃酸脱氢酶DMdh基因的亚克隆

6．2．2 突变体A89H的构建

6．2．3 蛋白的表达纯化

6．2．4 蛋白纯度表征及浓度测定

6．2．5 扁桃酸及邻氯扁桃酸的脱氢氧化

6．2．6 分子动力学模拟

6．3 结果与讨论

6．3．1 DMdh野生型对扁桃酸及邻氯扁桃酸的脱氢氧化

6．3．2 底物分子结构分析

6．3．3 DMdh野生型的结构及分子动力学模拟

6．3．4 突变体设计及活力测定

6．3．5 突变体的分子动力学模拟

6．4 本章小结

7 结论与展望

参考文献

附录

作者简历