黄瓜绿斑驳花叶病毒与甘蔗花叶病毒基因组测序及种群遗传结构分析

摘要

黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）和甘蔗花叶病毒（Sugarcane mosaic virus，SCMV）是农作物上的两种重要病毒，其分布范围广，危害重，给我国农业生产的发展造成了严重威胁。本论文主要围绕CGMMV和SCMV两个病毒的基因组测序及种群遗传结构分析、SCMV单克隆抗体制备及其应用等开展相关研究，取得如下研究结果:
　　1、7个CGMMV浙江分离物基因组测序及种群遗传结构分析
　　利用以CGMMV单抗为核心建立的dot-ELISA方法对采自浙江省不同地方的762份葫芦科作物、4批葫芦科作物种子及60份杂草样品进行CGMMV普查。结果显示，葫芦植株及其种子、西瓜植株及其嫁接苗、甜瓜植株等样品中均检测到CGMMV。另外，在田间杂草碎米芥和空心莲子草中检测到CGMMV的存在，这是CGMMV感染杂草的首次报道。根据CGMMV在浙江省的地理分布及不同作物上的发生情况，从中选取感染CGMMV的4株西瓜植株、2株西瓜嫁接苗和1株甜瓜植株样品进行病毒全基因组克隆和测序，获得了7个CGMMV浙江分离物全基因组序列。测序结果表明，CGMMV台州西瓜分离物和建德西瓜分离物的全基因组序列长度分别为6425 bp和6423 bp，2个东阳西瓜分离物全基因组序列长度分别为6423 bp和6425 bp，萧山西瓜嫁接苗和东阳西瓜嫁接苗分离物全基因组序列长度分别为6423 bp和6424 bp，CGMMV建德甜瓜分离物全基因组序列长度为6423 bp。同源性分析发现这7个分离物全基因组核苷酸同源性在99.2～100％之间。结合GenBank登录的24个CGMMV分离物构建系统进化树。结果显示，除分离物Ec外，其它分离物根据地理来源的不同分为两组，即亚洲分离物聚在组Ⅰ，欧洲分离物聚在组Ⅱ，表明CGMMV的种群分化极有可能受地理分布的影响。CGMMV全基因组核苷酸序列位点变异分析发现，其各个位点的变异率均在8％以下，大多集中在2～5％之间，表明CGMMV基因组较保守、变异较少。CGMMV碱基替换突变类型分析显示，其具有转换(A(←→)G和C(←→)T)明显强于颠换（A(←→)C、A(←→)T、G(←→)C和G(←→)T）的偏好性。发生在CGMMV基因组上的大多数变异均导致了非同义突变的产生，且由于碱基替换类型的强烈偏好性，一些氨基酸位点出现了高于30％的非同义替代率。选择压分析结果显示，在复制相关蛋白186 kDa和129 kDa ORF中检测到强烈的负向选择压，这与报道的发生在其它RNA病毒中的情况类似。最后，分离物Ec的重组分析发现，在多个重组检测中分离物Ec作为重组体的可信度均较低。
　　2、SCMV云南分离物的基因组测序及种群遗传结构分析
　　利用RT-PCR的方法检测来自云南田间的1个玉米样品，发现其感染SCMV。随后进行该分离物（命名为SCMV-YN）基因组克隆和测序，得到不合poly(A)长9598 bp的全基因组序列。这是SCMV云南玉米分离物在全基因组序列上的首次报道。基因组结构预测显示，SCMV-YN分离物的CI蛋白中典型的RNA解旋酶结构域V1215LLLEPTRPL1224突变成了V1215LLIEPTRPL1224，NIb蛋白C末端的原核脂蛋白结构域I2554LAFNYTLLSC2564突变成I2554IAFNYAMLSS2564。与GenBank登录的28个SCMV分离物全基因组核苷酸序列进行同源性比对发现，SCMV-YN与河北玉米分离物SCMV-BD8的同源性远远高于其它分离物，达到95.2％，且在这些分离物中，P1变异最大，CI和PIPO相比其它ORFs保守得多。基于全基因组核苷酸序列的系统进化树显示29个SCMV分离物被分为两组，即组Ⅰ和组Ⅱ。且在两大组内部又各分为两小组，分别为组Ⅰ A(Maize)、组ⅠB(Maize/Sugarcane)和组Ⅱ A(Maize/Sugarcane)、组Ⅱ B(Sugarcane)。且地理分布对分离物亲缘关系的影响有所弱化，寄主来源对分离物亲缘关系的影响依然存在。SCMV全基因组核苷酸位点变异分析发现，其各个位点变异程度存在明显波动，大多集中在15～20％之间，表明SCMV基因组存在高变异率。SCMV碱基替换突变类型与报道的其它RNA病毒类似，呈现转换（A(←→)G和C(←→)T）明显强于颠换（A(←→)C、A(←→)T、G(←→)C和G(←→)T）的偏好性。遗传差异及基因流分析显示，组Ⅰ和组Ⅱ分离物在所有ORFs中均存在显著的遗传差异;同时在P3、NIa-VPg、NIa-Pro和NIb-replicase等ORFs中检测到频繁的基因流。选择压分析显示，SCMV分离物编码的所有ORFs均处于负向（净化）选择压下，且CI ORF受到的负向选择压最大。重组分析显示，29个SCMV分离物中7个分离物检测到明显重组。且对这7个分离物的重组区域进行分析发现，除P3ORF外，其它区域均检测到了重组。
　　3、SCMV-YN分离物单抗的制备及其应用
　　用提纯的SCMV-YN病毒粒子免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、筛选与克隆成功获得9株能分泌SCMV单抗的杂交瘤细胞株(6A1、6A12、10B11、12A10、15C12、19F3、21C12、21H3和22A2），并制备单抗腹水。9株单抗腹水的间接ELISA效价在10-6～10-7之间，抗体类型及亚类均为IgG1、kappa轻链。Western blot分析发现，6A1、21H3和22A2这3个单抗对SCMV-YN和SCMV北京分离物均具有免疫反应，说明它识别的是这两个分离物外壳蛋白亚基的共同抗原决定簇;而10B11、12A10、15C12、19F3和21C12这5个单抗仅对SCMV-YN分离物具有免疫反应，说明它识别的是SCMV-YN分离物外壳蛋白亚基的特异性抗原决定簇。6A12单抗在Western blot时不识别SCMV外壳蛋白等病毒结构蛋白，结合其dot-ELISA结果推测该单抗识别的是针对构象型的抗原决定簇。以制备的单抗为核心建立dot-ELISA检测方法，并对其特性进行分析。特异性分析显示，6A1、21H3和22A2这3个单抗及以其为核心建立的dot-ELISA方法在检测SCMV-YN和北京分离物时均呈阳性反应;而6A12、10B11、12A10、15C12、19F3和21C12这6个单抗及以其为核心建立的dot-ELISA方法在检测SCMV-YN和北京分离物时，仅对SCMV-YN分离物呈阳性反应，这说明其可用于SCMV-YN分离物的株系鉴定和检测。dot-ELISA方法分析单抗灵敏度显示，6A1、15C12、10B11和21H3单抗对病叶的检测灵敏度均达到1∶10240倍稀释（w/v, g/mL），12A10和19F3单抗的检测灵敏度均达到1∶5120倍稀释(w/v, g/mL)，21C12和22A2单抗的检测灵敏度均达到1∶2560倍稀释（w/v, g/mL），而6A12单抗的检测灵敏度也到达1∶1280倍稀释(w/v, g/mL)。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 文献综述

1 黄瓜绿斑驳花叶病毒研究进展

1．1 CGMMV生物学特性

1．2 CGMMV危害症状

1．3 CGMMV基因组结构及功能

1．4 CGMMV的危害及全基因组序列的研究

2 甘蔗花叶病毒研究进展

2．1 SCMV生物学特性

2．2 SCMV基因组结构及功能

3 植物RNA病毒的检测

3．1 生物学鉴定法

3．2 电子显微镜观察法

3．3 血清学检测法

3．4 分子生物学检测法

4 RNA病毒的遗传变异与进化

4．1 RNA病毒变异机制

4．2 RNA病毒种群结构的系统分析

5 单克隆抗体技术及其在植物病毒学中的应用

5．1 单克隆抗体技术

5．2 单克隆抗体在植物病毒学中的应用

6 本研究的目的及意义

第二章 CGMMV分离物基因组测序及种群遗传结构分析

1 材料与方法

1．1 葫芦科作物、杂草及其种子样品的采集

1．2 试剂

1．3 dot-ELISA检测样品中CGMMV

1．4 CGMMV的检测及分离物全基因组序列测定

1．5 序列分析

2 结果与分析

2．1 CGMMV在浙江省的发生情况调查

2．2 7个CGMMV浙江分离物全基因组序列测定及同源性分析

2．3 CGMMV种群遗传结构分析

3 讨论

第三章 SCMV云南分离物基因组测序及种群遗传结构分析

1 材料和方法

1．1 病毒样品的采集

1．2 试剂

1．3 SCMV云南分离物的检测与全基因组序列测定

1．4 核酸序列分析和重组检测

2 结果与分析

2．1 RT-PCR方法鉴定云南田间玉米样品感染SCMV

2．2 云南田间玉米样品中SCMV的全基因组序列扩增

2．3 SCMV-YN玉米分离物全基因组序列结构分析

2．4 与其它SCMV分离物同源性比较

2．5 SCMV种群遗传结构分析

3 讨论

第四章 甘蔗花叶病毒单抗的制备及其应用

1 材料和方法

1．1 病毒来源

1．2 试剂及实验材料

1．3 病毒粒子的提纯

1．4 单抗的制备、腹水效价测定和抗体类型及亚类鉴定

1．5 Western blot分析单抗的特性

1．6 dot-ELISA方法的建立及其特异性和灵敏度分析

2 结果与分析

2．1 SCMV的提纯及抗原制备

2．2 杂交瘤细胞的融合、筛选和克隆

2．3 腹水抗体制备、效价测定及抗体亚类鉴定

2．4 单抗的Western blot分析

2．5 dot-ELISA方法的建立及SCMV单抗的特性分析

3 讨论

全文小结

展望

参考文献

附录