不同油源对山麻鸭蛋黄脂类含量的影响及肝脂代谢调控机制的初步研究

摘要

鸭蛋作为重要的营养来源，蛋黄中的n-3多不饱和脂肪酸（n-3PUFAs）和胆固醇含量对其品质有重要影响。目前通过改变日粮脂肪酸成分来改善蛋黄n-3PUFAs及胆固醇含量的研究较多，然而其调控作用机制十分复杂，迄今为止尚未完全阐明。此外，综合研究蛋品质、肠道微生物以及脂类代谢的分子调控过程的文献鲜有报道。本试验以山麻鸭为研究对象，研究了不同油源（牛油T、菜籽油R、亚麻籽油FL和鱼油F）对蛋品质、蛋黄脂肪酸和胆固醇含量的影响，并通过数字基因表达谱技术(Digital Gene Expression，DGE)、实时定量PCR(q-RT-PCR)技术、鸭肝原代细胞培养和诱导等方法研究山麻鸭脂肪酸和胆固醇代谢的调控通路，挖掘多不饱和脂肪酸和胆固醇代谢相关候选基因，初步阐明了日粮多不饱和脂肪酸降低蛋黄胆固醇并增加n-3PUFAs的分子机制。同时，为综合研究日粮油脂对山麻鸭的影响，本文分析了对照组和2％鱼油组山麻鸭肠道形态及肠道微生物区系的差异。
　　1.不同油源对山麻鸭蛋品质、蛋黄脂肪酸和胆固醇含量的影响
　　将585只370日龄产蛋性能良好的山麻鸭分为对照组(C)、牛油组(T)、菜籽油组(R)、亚麻籽油组(FL)和鱼油组(F)，每种油源设3个浓度梯度，分别为0.5％、1％和2％，饲喂后第28天检测蛋品质、蛋黄脂肪酸及胆固醇含量。结果显示，4种油源的任意添加水平均对山麻鸭蛋品质的影响不显著。鱼油、亚麻籽油和菜籽油能降低(P＜0.001)蛋黄总胆固醇(TC)、饱和脂肪酸(SFAs)和单不饱和脂肪酸(MUFAs)含量，而显著增加多不饱和脂肪酸(PUFAs)、n-6多不饱和脂肪酸（n-6PUFAs）、n-3多不饱和脂肪酸(n-3PUFAs)、二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)含量。并且，鱼油、亚麻籽油和菜籽油提高蛋黄EPA和DHA的作用具有剂量效应。这表明富含不饱和脂肪酸的日粮能够在保证蛋品质不受影响的情况下，增加山麻鸭蛋黄n-3PUFAs含量并降低蛋黄胆固醇含量。
　　2.日粮鱼油和亚麻籽油调控山麻鸭肝脂代谢的转录组分析
　　在油脂添加试验第28天采集对照组、2％鱼油组和2％亚麻籽油组山麻鸭肝脏组织，提取肝脏总mRNA，反转录，并进行转录组测序，以转录组从头组装(RNA-Seq de novo)结果为参考基因组进行肝脏DGE分析。首先，全部9个样本做混池(pool)处理，进行RNA-Seq de novo，该过程共检测到53.2M clean reads，注释获得55，426个Unigenes。其中27，376个与公共数据库中的蛋白质序列有同源性。然后，三个组共构建9个DGE（数字基因表达谱，Digital Gene Expression）数据库，平均每个DGE产生10M clean reads，其中88-92.5％可注释到RNA-Seq de novo结果中。与C相比，分别在FL和F组检测到896和883个DEGs（差异表达基因，Different Expressed Genes），其中分别有36和25个与脂类代谢通路相关。与对照组相比，亚麻籽油显著降低花生四烯酸(ARA)代谢相关基因(PTGS1、CYP2U)、胆固醇代谢相关基因(CYP3A、CYP2J、CYP2C)、初级胆汁酸合成相关基因（CYP8B1↓、CYP7A1↑）和其他脂肪酸合成相关基因（FASN、ACSL、SCD），鱼油显著降低CYP8B1、ACSL和FASN基因表达，显著促进亚油酸代谢相关基因(CYP2C和CYP2J)的表达，同时显著降低与长链多不饱和脂肪酸合成相关的ELOVL2和FADS2基因的表达，这表明鱼油和亚麻籽油调节山麻鸭脂类代谢的机制有所不同。此研究丰富了山麻鸭遗传信息，并为鱼油和亚麻籽油降低动物产品胆固醇和增加n-3PUFAs的研究提供了分子调控机制的基础。
　　3.18C脂肪酸对鸭肝细胞n-3LCPUFAs合成相关基因转录和表达的影响
　　本研究通过两步胶原酶灌流法分离山麻鸭雏鸭肝脏细胞，并采用常规肝细胞培养方法进行培养。通过MTT法检测培养周期内细胞生长曲线，同时对细胞进行糖原染色(Periodic Acid-Shiff stain，PAS)和膜蛋白CK18免疫化学鉴定，并观察不同时期细胞形态。山麻鸭原代肝细胞培养24h后分别加入200μMα-亚麻酸(ALA，C18∶3)和硬脂酸(SA，C18∶0)，诱导48h后，提取细胞总RNA、总蛋白质和总脂肪酸，采用Real-time PCR法分析n-3LCPUFAs合成相关基因的表达，采用双向电泳(Two-dimensional electrophoresis，2-DE)及质谱法分析差异表达蛋白质，采用质谱法分析脂肪酸成分。结果显示，SA和ALA显著降低ELOVL2和FADS1基因的转录，SA显著提高FADS2的转录;2-DE-质谱法未检测出与脂类代谢合成直接相关的差异表达蛋白;SA对SFAs、MUFA、n-3PUFAs、ALA、EPA和DHA含量影响均不显著，ALA则显著提高n-3PUFAs、ALA和EPA的含量。该结果表明:1）ALA在肝细胞中能转化为EPA和DHA，而SA则无此功能;2）ALA和SA都能改变n-3LCPUFAs合成相关基因的表达，但是机制还有待进一步研究;3）2-DE法不适合进行鸭肝细胞脂类代谢相关蛋白的差异分析。
　　4.日粮鱼油对山麻鸭不同肠道部位形态及微生物区系的影响
　　以对照组山麻鸭5个肠道部位（十二指肠、空肠、回肠、盲肠、直肠）组织及其内容物为研究对象，通过组织染色法及16S rDNA V3-V4区测序技术检测其不同部位肠道形态及微生物群落的差异，同时研究基础日粮添加2％鱼油对肠道形态及微生物群落的影响。结果表明回肠绒毛高度和隐窝深度之比(VH/CD)最高，直肠次之。直肠具有最多杯状细胞(GC)，其他部位差异不显著。鱼油显著降低回肠VH/CD，对其他肠道部位VH/CD影响不显著，但鱼油导致肠道绒毛变得窄瘦，甚至有些部位绒毛发生粘连。16S rDNA V3-V4区测序所获得Clean Tags共分为1，987个操作分类单元(OTUs)，获得197个属。十二指肠OTU数目最少，回肠OTU数目最多，鱼油组各肠段OTU数目整体上低于对照组。Alpha多样性分析表明十二指肠微生物多样性最低，鱼油显著降低直肠微生物多样性。从LEfSe(linear discriminant analysis coupled with effect size)分析结果中选取乳酸菌属（Lactobacillus）、梭菌钢（Clostridia）、巨单胞菌属（Megamonas）和弯曲菌目（Campylobacterales）进行细菌属性分析。结果表明日粮添加2％鱼油会伤害肠道形态，降低肠道微生物的丰度和多样性。本研究为全面了解山麻鸭不同肠道部位微生物组成提供了可靠依据，并为比较鱼油在山麻鸭生产中的添加效果提供了肠道方面的研究基础。
　　本文较全面的研究了基础日粮添加不同油源对山麻鸭蛋品质、蛋黄脂类成分、肝脏脂类代谢和肠道微生物的影响，结果表明3个浓度（0.5％、1％和2％）的鱼油、亚麻籽油、菜籽油和牛油均未显著影响山麻鸭蛋品质，但是，鱼油、亚麻籽油和菜籽油显著增加了蛋黄n-3PUFAs并显著降低了蛋黄胆固醇含量;日粮添加2％鱼油和2％亚麻籽油降在转录水平上的调控既有相同又有所不同，相同的是两者都增加初级胆汁酸合成并降低脂肪酸合成，不同的是鱼油促进亚油酸代谢且降低n-3LCPUFAs合成相关基因的转录，而亚麻籽油则抑制亚油酸代谢和花生四烯酸代谢;另外，日粮添加2％鱼油对山麻鸭肠道形态和微生物区系有不利影响。不同油源在蛋鸭养殖业中的效果还有待结合饲料转化率等指标进行进一步的评价。

目录

声明

摘要

缩略词

文献综述

第一节 蛋鸭脂类代谢概述

1．2 PUFAs的重要作用

1．3 人类对PUFAs的紧迫需求

1．4 胆固醇与人类健康

第二节 日粮油脂对家禽脂类代谢调控作用的研究

2．1 鱼油

2．2 植物油

2．3 其他可改善禽蛋脂类成分的非油脂添加剂

第三节 家禽肠道形态和微生物区系概述及其研究方法

3．1 肠道形态与肠道功能的关系

3．2 肠道微生物对宿主的影响及研究方法

3．3 16S rDNA测序技术及其应用

3．4 肠道微生物在家禽研究中的应用

3．5 肠道微生物对胆固醇代谢的影响

第四节 测序技术和脂类代谢相关基因的概述

4．1 转录组测序

4．2 蛋白质组学简介

4．3 脂类组学简介

4．4 相关基因简介

第五节 肝细胞的分离培养与应用

5．1 肝细胞的分离方法

5．2 肝细胞的原代培养

5．3 肝细胞的鉴定

5．4 家禽原代肝细胞在脂类代谢研究中的应用

试验研究

第一章 不同油源对山麻鸭蛋黄脂肪酸组成和胆固醇含量的影响

1．1 材料与方法

1．2 结果与分析

1．3 小结

第二章 日粮鱼油对山麻鸭不同肠道部位形态及微生物区系的影响

2．1 材料与方法

2．2 结果与讨论

2．3 小结

第三章 日粮鱼油和亚麻籽油调控鸭肝脂代谢的分子机制研究

3．1 材料与方法

3．2 结果与讨论

3．3 小结

第四章 18C脂肪酸对鸭肝细胞的调节作用

4．1 材料与方法

4．2 结果与讨论

4．3 小结

总结

创新点

不足之处与展望

参考文献

附录

作者简介

致谢