印度梨形孢降低烟叶重金属含量机理的初步研究

摘要

在植物体内普遍存在的内生真菌与宿主植物协同进化，形成互惠共生关系。内生真菌能增强植物抗生物和非生物胁迫的能力，从印度塔尔沙漠的灌木根中分离出的印度梨形孢Piriformospora indica，能显著提高植物对生物和非生物胁迫的抗性。
　　烟草Nicotiana tabacum是我国重要的经济作物，也是生物学研究中重要的模式植物。前期的研究结果表明，根部接有印度梨形孢的烟草叶片中重金属镉(Cd)、铬(Cr)、铅(Pb)含量显著低于未接种烟草，而根部则显著高于对照。本论文在此研究的基础上从印度梨形孢菌丝体本身对重金属的富集作用，对烟草根系中重金属的固定作用，诱导烟草抗逆相关生理生化指标的变化与重金属胁迫相关基因的表达量的变化等方面对印度梨形孢降低烟叶重金属含量的机理进行了研究，主要研究结果如下:
　　1.印度梨形孢菌丝体本身对Cd、Cr和Pb具有富集作用
　　采用平板试验法研究印度梨形孢对重金属Cd、Cr和Pb的富集作用，结果表明:在重金属Cd浓度4 mg·L-1、Cr浓度30 mg·L-1和Pb浓度5 mg·L-1分别胁迫下，印度梨形孢菌丝体仍能够生长。采用微波消解-石墨炉原子吸收光谱法测定，印度梨形孢菌丝体内的Cd、Cr和Pb含量均显著高于对照，表明在一定浓度重金属胁迫下，印度梨形孢对重金属Cd、Cr和Pb具有富集作用。
　　2.印度梨形孢对Cd、Cr和Pb胁迫下烟草农艺性状的影响
　　水培试验结果表明:Cd、Cr和Pb胁迫下，根部接有印度梨形孢的烟叶干重、茎围、最大叶长、最大叶宽等农艺性状均显著优于根部未接有印度梨形孢的烟草，印度梨形孢提高了烟草对重金属胁迫的抗性。
　　3.水培试验研究印度梨形孢对烟草根部和叶部Cd、Cr和Pb含量的影响
　　水培试验结果表明:重金属未胁迫时，根部接与未接印度梨形孢的烟草根和叶中Cd、Cr、Pb含量差异不显著;在1 mg·L-1 Cd、5 mg·L-1Cr和5 mg·L-1 Pb分别胁迫两周后，根部接有印度梨形孢的烟草叶片中Cd、Cr和Pb含量均显著低于未接种烟草，而根部Cd、Cr和Pb含量均显著高于对照。
　　4.采用共聚焦显微拉曼光谱技术研究印度梨形孢对烟草根系中重金属的固定作用
　　显微拉曼光谱扫描下可见，在5mg·L-1 Cr胁迫下，根部未接印度梨形孢的烟草根部表皮层与皮层细胞受损严重，中柱细胞可见黑色区域;接有印度梨形孢的烟草根细胞形态正常，细胞排列紧密，从表皮层、皮层到中柱细胞均可见黑色区域。经拉曼光谱分析证实黑色区域为重金属Cr。结果表明，印度梨形孢的定殖使很大部分Cr固定在根表皮层。
　　5 Cd、Cr和Pb胁迫下印度梨形孢对烟叶抗氧化物质的影响
　　Cd、Cr和Pb胁迫下，根部接有印度梨形孢的烟叶中抗坏血酸(AsA)、谷胱甘肽(GSH)含量和超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性均显著高于未接种烟草;同时平板试验研究表明一定浓度重金属胁迫下印度梨形孢菌丝内这些抗氧化物质也增加，表明印度梨形孢的介导提高了烟草对逆境胁迫的抗性，提高了根部对重金属Cd、Cr和Pb的耐性。
　　6 RT-PCR分析印度梨形孢对烟草中重金属胁迫相关基因表达量的影响
　　RT-PCR分析测定了重金属Cd、Cr和Pb胁迫下水培烟草根中植物螯合肽合成相关基因Hmt1、Hmt2、CAD1及烟草叶片中金属硫蛋白基因MT2、病程相关蛋白基因PR2和Chitinase的表达。结果是:1 mg·L-1Cd胁迫下接有印度梨形孢的烟草根中基因Hmt1、Hmt2、CAD1、烟草叶中基因MT2、PR2和Chitinase的表达量分别是未接种的4.04、1.68、2.02、1.98、4.48、1.87倍，5mg·L-1 Cr和5mg·L-1 Pb胁迫下这些基因的表达量在接有印度梨形孢的烟草中分别是未接种的2.82、1.52、1.55、1.25、2.51、1.59倍和2.65、2.01、1.42、1.32、2.17、1.53倍。
　　综上所述，印度梨形孢可通过其菌丝体本身对重金属的富集作用，提高根部对重金属的积累作用，激活抗氧化系统的活性，提高与重金属胁迫相关基因的表达，提高烟草的生物量，提高烟草对逆境胁迫的抗性，从而改变重金属Cd、Cr和Pb在烟草组织中的分布，减少叶部重金属的积累量。

目录

声明

致谢

论文说明

摘要

第一章 文献综述

1 印度梨形孢的形态特征及分类地位

2 印度梨形孢功能性研究进展

2．1 印度梨形孢的寄主范围

2．2 国外对印度梨形孢作用研究进展

2．3 国内对印度梨形孢作用研究进展

3 重金属对烟草生长及品质的影响

4 共聚焦显微拉曼光谱技术在植物细胞壁组成和结构分析中的研究进展

5 真菌提高植物耐重金属胁迫的可能机制

6 植物耐重金属胁迫相关因子

6．1 活性氧清除系统

6．2 植物螯合肽和金属硫蛋白

6．3 植物耐重金属相关基因

7 本研究的目的和主要研究内容

第二章 印度梨形孢对重金属的富集作用

1 材料与方法

1．1 供试材料

1．2 所需培养基

1．3 试验方法

2 结果与分析

2．1 不同浓度Cd、Cr、Pb对印度梨形孢生物量的影响

2．2 重金属胁迫时透射电镜与扫描电镜下印度梨形孢菌丝体结构变化

2．3 重金属镉胁迫下印度梨形孢菌丝体组成成分的拉曼光谱分析

2．4 不同浓度Cd胁迫下印度梨形孢菌丝体内抗氧化物质的变化

2．5 不同浓度Cr胁迫下印度梨形孢菌丝体内抗氧化物质的变化

2．6 不同浓度Pb胁迫下印度梨形孢菌丝体内抗氧化物质的变化

第三章 印度梨形孢降低烟叶重金属含量的机理

1 材料与方法

1．1 供试材料

1．2 所需培养基

1．3 方法

2 结果与分析

2．1 印度梨形孢在烟草根部的定殖

2．2 水培条件下重金属对烟草表型的影响

2．3 重金属对烟草农艺性状的影响

2．4 重金属胁迫下印度梨形孢对水培烟草重金属含量的影响

2．5 烟草根系中印度梨形孢对重金属Cr的固定

2．6 印度梨形孢介导下重金属胁迫对烟草根部细胞超微结构的影响

2．7 Cd胁迫下根部接印度梨形孢的烟叶内抗氧化物质的变化

2．8 Cr胁迫下根部接印度梨形孢的烟叶内抗氧化物质的变化

2．9 Pb胁迫下根部接印度梨形孢的烟叶内抗氧化物质的变化

2．10 印度梨形孢介导下烟草中与重金属胁迫相关基因表达量分析

3 小结与讨论

第四章 结论与展望

4．1 主要研究结论

4．2 主要创新点

4．3 不足与展望

参考文献

附录