HMGA2在结直肠癌产生5-氟尿嘧啶耐药性中的作用及相关机制的研究

摘要

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是全世界最常见的恶性肿瘤之一，其发病率仅次于肺癌和乳腺癌，位居恶性肿瘤的第三位;而死亡率则次于肺癌、肝癌和胃癌，位列恶性肿瘤的第四位。当肿瘤呈局灶性时，通过根治性手术切除并在术后进行辅助化疗已经成为Ⅲ期结直肠癌患者的治疗准则。尽管近年来种类繁多的药物开始用于结直肠癌的化疗，5-氟尿嘧啶（5-FU）仍然是结直肠癌治疗中最广泛应用的药物。虽然以5-FU为基础的化疗已经取得了很大的进步，但是超过90％化疗失败的病人是由于对该药产生了耐药。因此，积极开展对结直肠癌耐药机制的研究，寻找新的关键分子和治疗靶点，对结直肠癌的干预和治疗具有重要的意义。
　　高迁移率族蛋白A2(High Mobility Group AT-hook2)，简称HMGA2，定位于12q13-15。HMGA2蛋白包含5个外显子，其中前三个外显子编码“AT-hook”结构域，该结构域可以使HMGA2与B型DNA相结合。HMGA2能够通过3个“AT-hook”结构域与下游靶基因所在的染色体结合并改变其结构，继而上调或下调下游靶基因的转录，从而在胚胎形成、组织发育和肿瘤发生等多个过程中发挥重要作用。相关研究证明HMGA2在低分化的结直肠癌以及结直肠癌肝转移的病灶中高表达，并且HMGA2的表达与结直肠癌病人的生存呈负相关。因此，为探讨HMGA2对结直肠癌发生发展的影响，并且进一步明确HMGA2对5-FU耐药的作用及分子机制，我们进行了本课题的相关研究。
　　我们首先在mRNA和蛋白水平，检测了多个CRC细胞系中HMGA2的表达，发现在SW480、RKO和HCT116细胞中高表达，在HT29、SW620、LoVo和CW2细胞中低表达。因此，我们在SW620和HT29细胞系中建立了稳定过表达HMGA2的单克隆细胞株(SW620-NC/A2、HT29-NC/A2)，而在HCT116和RKO细胞系中构建了稳定干扰HMGA2的单克隆细胞株(HCT116-NC/shA2、RKO-NC/shA2)。随后我们通过Transwell迁移、Matrigel侵袭实验、MTT、Western Blot、平板克隆实验、Real-time RT-PCR以及流式细胞分析等方法，分析HMGA2对结直肠癌细胞迁移、侵袭、EMT、增殖以及对5-FU治疗敏感性的影响。我们发现，在结直肠癌细胞系中过表达HMGA2可以促进结直肠癌细胞的迁移、侵袭、EMT、增殖，并增加5-FU耐药性;而沉默HMGA2的表达可抑制结直肠癌细胞的迁移、侵袭、EMT、增殖，和降低5-FU耐药性。同时，我们进一步选取SW620-NC/A2和HCT116-NC/shA2两对细胞系进行裸鼠皮下成瘤实验，选取SW620-NC/A2一对细胞系进行5-FU给药实验，结果显示HMGA2的过表达可以促进裸鼠的成瘤能力，增强EMT效应并促进肿瘤对5-FU的耐药。以上体内和体外实验结果表明HMGA2的过表达可以促进结直肠癌迁移、侵袭、EMT、增殖以及对5-FU的耐药。
　　为进一步研究HMGA2对5-FU耐药性的影响，我们搜索了GEO公共数据库中有关结直肠癌病人接受5-FU化疗的相关数据信息，并选择检索号为GSE28702的数据进行进一步的分析。结果显示HMGA2在以5-FU为基础的辅助化疗敏感的结直肠癌病人与化疗不敏感的结直肠癌病人中的表达存在显著差异，并且在对化疗不敏感的病例中HMGA2的表达呈现明显上调。
　　HMGA2作为一个转录因子，能够引起一系列细胞信号通路的变化，我们应用基因集富集分析软件GSEA(gene set enrichment analysis)，对结直肠癌TCGA数据库中HMGA2相关的信号通路进行富集分析。同时，我们对SW620-NC/A2一对细胞系进行基因表达谱芯片分析，筛选差异表达基因，并应用DAVID在线分析平台对差异表达倍数＞2倍的基因进行通路富集分析。结果显示，HMGA2与Wnt通路具有显著相关性。因此，这些证据表明，在结直肠癌中，HMGA2与Wnt通路密切相关。
　　为探究HMGA2所调控的下游靶基因，我们应用ChIP-on-chip芯片，寻找与HMGA2直接结合的下游靶基因。芯片结果提示，Wnt/β-catenin信号通路相关元件Dvl2的启动子-264/203区域上可能存在HMGA2的转录调控结合位点。SW620-NC/A2、HCT116-NC/shA2及RKO-NC/shA2中的Western Blot检测表明HMGA2的高表达能够上调Dvl2的表达，而HMGA2的稳定干扰能够下调Dvl2的表达。为进一步研究HMGA2是否在转录水平调控Dvl2的表达，我们构建了包含不同长度Dvl2启动子片段的报告基因载体，应用双荧光素酶报告基因实验检测HMGA2对不同长度Dvl2启动子片段的影响。结果显示，在293T细胞中，HMGA2的过表达能够激活Dvl2的启动子区域-1800/+217、-488/+217及-264/+217的转录活性;而当-264/+217缺失时，报告基因的激活作用消失，证明Dvl2的启动子区域-264/+217在HMGA2转录激活Dvl2中发挥重要作用。随后，我们在该区域进行点突变，双荧光素酶报告基因实验结果显示位点-201/-185发生突变时报告基因的激活作用消失，揭示HMGA2可能通过直接结合Dvl2启动子-201/-185的位点转录活化Dvl2。为证明HMGA2能够与Dv12的启动子区域直接结合，我们应用染色质免疫共沉淀实验(ChIP)证明两者的直接结合位点位于Dv12启动子区域-264/-100。同时，为进一步探究Dvl2是否参与HMGA2引起肿瘤生物学行为变化的过程，我们在SW620-NC/A2细胞系中干扰Dvl2，应用Western Blot检测细胞中5-FU耐药相关蛋白MMP7的表达情况，结果显示当干扰Dvl2后，过表达HMGA2引起的结直肠癌细胞对5-FU的耐药作用减弱。以上结果表明HMGA2能够与Dvl2的-201/-185启动子区域直接结合，并转录激活其表达，从而增强结直肠癌细胞对5-FU的耐药。
　　为了证明HMGA2参与激活Dvl2下游的Wnt信号通路，我们应用Real-timePCR和Western Blot检测结直肠癌细胞系过表达及干扰HMGA2后Wnt通路相关基因的表达情况，结果显示HMGA2的上调可以增加Wnt通路相关基因(β-catenin、c-Myc、cyclin D1、MMP7、CD44)的表达，反之亦然。同时，我们在HCT116-NC/shA2细胞系中，应用TOP Flash/FOP Flash双荧光素酶报告基因实验（检测胞内Wnt/β-catenin信号通路活性）发现，干扰HMGA2可以抑制Wnt/β-catenin信号通路的活性。随后我们进一步探究Wnt/β-catenin信号通路是否直接受HMGA2所调控，我们在HCT116-NC/shA2细胞系中加入2mM LiCl（Wnt/β-catenin信号通路激活剂）刺激48h之后，应用Western Blot检测Wnt通路相关元件MMP7和CD44的表达情况，结果显示沉默HMGA2后加入LiCl可以恢复由于HMGA2干扰引起的Wnt/β-catenin信号通路的减弱。以上结果表明，HMGA2能够调控Wnt/β-catenin信号通路。
　　最后，我们收集61例术后接受以基于5-FU的辅助化疗的结直肠癌病人的组织样本，应用免疫组化的方法检测HMGA2和Dvl2的表达情况并使用Kaplan-Meier法对不同HMGA2和Dvl2表达水平的患者之间预后生存的差异进行分析，结果显示Dvl2与HMGA2表达呈正相关的线性关系，无论HMGA2还是Dvl2，其高表达的病人生存率显著低于低表达的病人。
　　综合上述研究结果，我们得出以下结论:
　　1.在结直肠癌中，HMGA2能够促进细胞的迁移、侵袭、EMT、增殖以及对5-FU的耐药。
　　2.HMGA2能够与Dvl2的-201/-185启动子区域直接结合，并激活其转录。
　　3.HMGA2通过Wnt/β-catenin信号通路增强结直肠癌细胞对5-FU的耐药。

目录

声明

致谢

摘要

缩略语

1．引言

2．仪器设备和试剂

2．1 仪器设备

2．2 主要生物化学试剂

2．3 抗体

2．4 所用溶液配方

2．4．1 细胞培养、转染相关溶液细胞培养、转染相关溶液

2．4．2 DNA琼脂糖凝胶电泳相关溶液

2．4．3 Western blot相关溶液

2．4．4 克隆相关试剂

2．4．5 染色质免疫共沉淀相关试剂

3 材料和方法

3．2．1 荧光素酶报告基因载体的构建

3．2．2 荧光素酶报告基因检测

3．2．3 Real-time PCR实验

3．2．4 Western Blot

3．2．5 免疫组织化学

3．2．6 染色质免疫共沉淀

3．2．7 MTT

3．2．8 流式细胞仪检测细胞周期

3．2．9 平板细胞克隆形成实验

3．2．10 Transwell小室迁移实验

3．2．11 Transwell小室侵袭实验

3．2．12 EdU渗透实验

3．2．13 裸鼠成瘤及5-FU给药实验

3．2．14 临床样本分析

3．2．15 统计学分析

4 结果

4．1 构建过表达／干扰HMGA2的结直肠癌细胞系

4．1．1 不同结直肠癌细胞系中HMGA2的表达

4．1．2 建立稳定过表达／干扰HMGA2的单克隆结直肠癌细胞系

4．2 HMGA2促进结肠癌细胞迁移、侵袭、EMT以及增殖

4．2．1 HMGA2的变化对结直肠癌细胞系迁移、侵袭和EMT的影响

4．2．2 HMGA2的变化对结直肠癌细胞系增殖的影响

4．3 HMGA2促进结肠癌细胞的裸鼠皮下成瘤能力及EMT过程

4．4 HMGA2在对5-FU不敏感的结肠癌组织中表达上调

4．5 在体外，HMGA2促进结肠癌细胞对5-FU的耐受

4．6 在体内，HMGA2促进结肠癌对5-FU的耐受

4．7 HMGA2调控下游基因及信号通路的筛选

4．7．1 应用TCGA数据库分析HMGA2调控的下游基因及信号通路

4．7．2 应用表达谱芯片分析HMGA2调控的下游基因及信号通路

4．8 HMGA2通过转录调控Dvl2促进结直肠癌细胞对5-FU的耐药

4．8．1 HMGA2能够与Dvl2的启动子区域(-201／-185)直接结合，并激活其转录

4．8．2 HMGA2通过Dvl2促进结直肠癌细胞系对5-FU的耐药

4．9 HMGA2活化调控Wnt／β-catenin信号通路

4．10 在临床组织样本中Dvl2的高表达促进结直肠癌对5-FU的耐药

5 讨论

6 结论

参考文献

综述 High mobility group AT-hook 2 and cancer

作者简历及在读期间所取得科研成果