肿瘤耐药新证据——源于单个细胞的克隆快速随机产生药物反应多样性

摘要

研究背景:
　　目前肿瘤细胞耐药仍是肿瘤治愈的主要障碍。近来，越来越多的研究证明肿瘤内异质性是肿瘤细胞耐药的主要原因之一。单细胞基因测序技术证明了同一个肿瘤不同空间存在基因的多态性。肿瘤内异质性产生的原因通常包括:基因组的变化、随机过程、微环境的改变以及细胞组织的可塑性。
　　精准医疗的提出是基于肿瘤的异质性，主要是基于肿瘤细胞基因表达的差异给予个体化治疗或在患者的不同阶段给予相应的治疗。然而，这种异质性的基础是真的异质性，即基因组的差异引起的真的表型差异，然而基因表达的差异并不仅仅由于基因组的差异造成，由其他原因如表观遗传学或随机性过程导致的基因表达差异，在精准医疗下是否还能给患者带来获益，这是需要冷静思考的问题。
　　同一细胞系内的肿瘤细胞亦可被认为是由具有异质性的肿瘤细胞所构成。然而尚未有研究报道来自于同一细胞系或单个肿瘤细胞的克隆对于药物的反应性会存在多大差异。我们选择细胞系为模型，探讨在同一细胞系内或单个肿瘤细胞的子代克隆的药物反应谱的多态性。
　　研究方法:
　　我们分别研究了4T1、Bcap37、K562三个细胞系。首先，利用极限稀释法获得单细胞克隆一代(4T1、Bcap37、K562)，MTT方法测定多种化疗药物的半数抑制浓度(IC50)，实时荧光定量PCR方法检测耐药相关基因的转录组表达。然后，在上述一代克隆中挑选某一克隆再次利用极限稀释法获得单细胞二代子克隆，同样测定其不同药物的IC50以及相关基因mRNA表达。另外通过聚类分析的统计学方法检验上述一代及二代克隆在IC50和基因mRNA表达的异质性是否具有统计学差异。
　　值得注意的是，在4T1细胞系中，我们利用基质胶3D培养的方法以及CD24/CD44免疫荧光分选出了具有干性特征的细胞。
　　研究结果:
　　1.4T1细胞系单细胞克隆及二代子克隆的异质性
　　CD24+CD44+细胞并且3D培养能够产生分化的腺管结构的这群克隆S和CD24+CD44-并且不能培养出腺管结构的这群克隆N，两群克隆内部均存在明显的异质性。11个单细胞克隆S或N在11个传统化疗药物的反应谱均存在明显的差异，表现在:对于某一个药物，11个克隆间的IC50有显著差别;对于某一个克隆，在11种药物表现出不同的反应谱。同样，19个耐药相关基因mRNA的表达的差异性亦存在。
　　而且，利用相同培养条件，未予药物刺激，获得的单细胞克隆S1或N2的二代子克隆仍表现出药物反应谱及基因表达谱的明显差异，与一代克隆表现一致。此外，分别以药物IC50和基因表达作为变量对上述克隆（一代克隆或二代子克隆）进行聚类分析统计，均出现多个分类。
　　2.Bcap37细胞系单细胞克隆及二代子克隆的异质性
　　源自于Bcap37细胞系的一代以及二代单细胞克隆在9种传统化疗药物的反应谱存在多态性。但是差异性不及4T1细胞系的克隆那么大，最大差异倍数仅为8倍，而4T1细胞系的S组克隆间的最大差异倍数为273倍。而且，源自于Bcap37细胞系克隆的药物IC50绝对值比4T1细胞系克隆的IC50值大，这也指出不同细胞系之间的个体差异。同样，一代及二代克隆的耐药相关基因mRNA表达亦存在明显差异性。聚类分析同样验证了上述克隆或子克隆存在多个类别。
　　3.K562细胞系单细胞克隆及二代子克隆的异质性
　　靶向药物伊马替尼在一代单细胞克隆间的IC50存在差异性，而在二代子克隆间无明显差异。
　　而对于传统化疗药物，在一代及二代单细胞克隆间的药物反应谱均有明显异质性。BCR/ABL融合基因及其他耐药相关基因转录组的表达无论在一代或二代克隆间亦表现出明显差异。c-Abl蛋白的表达在一代及二代克隆间亦存在显著差异。
　　此外，在分别以传统化疗药物IC50和相关基因表达作为变量对上述克隆（一代克隆或二代子克隆）进行聚类分析，均出现了多个分类。且通过单因素方差分析也验证了c-Abl蛋白的表达差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　结论:
　　结果表明，单个肿瘤细胞能够重新繁衍出一群基因组背景相同，然而药物反应谱显著不同的子代单细胞克隆，并且这类药物反应多态性的获得不需要药物的预刺激，是完全随机的。该结果首次提出了由单个细胞衍化而来的稳定增殖的子代克隆间存在药物反应异质性。

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致谢

摘要

插图和表格清单

缩略语表

1 绪论

2 实验材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

3 实验结果

3．1 4T1细胞系单克隆的异质性表型

3．2 Bcap37细胞系单克隆的异质性表型

3．3 K562细胞系单克隆的异质性表型

4 讨论

参考文献

综述 肿瘤内异质性的研究现状

作者简历及在学期间的所取得的科研成果