低氧通过抑制miR-218激活PERK在低氧性肺动脉高压中作用研究

摘要

肺动脉高压(PH)是一种涉及多种临床状况并会使大多数心血管及呼吸系统疾病复杂化的病理生理紊乱。有报导显示PH患病率为97/百万人，年龄标准化的死亡率为4.5-12.3/十万人。低氧性肺动脉高压(HPH)是由肺部疾病和（或）低氧所致的肺动脉高压，常见于间质性肺疾病及慢性阻塞性肺病，肺部疾病发展致PH时均伴有运动能力的恶化，低氧加重和生存时间缩短。因此，对其发病机制进行研究有重要意义。
　　MicroRNA是一种长度约22nt的小分子非编码RNA，研究显示与肺动脉高压相关的因素如低氧、炎症等均可以调节microRNA的表达。近年来，microRNA作为一种上游信号分子在PH肺血管重塑中的作用受到关注，而且越来越多的研究表明，microRNA有望作为PH治疗的新靶点。
　　本课题组通过芯片技术在HPH大鼠肺组织中发现了一批表达变化的microRNA，从中挑选出了表达降低的miR-218。在大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)中研究其对PASMCs增殖、迁移、凋亡的影响，并对其进行靶基因预测和验证。在HPH大鼠模型中特异性抑制miR-218靶基因PERK，检测抑制PERK对HPH肺动脉压力及肺血管重塑的影响。本研究为HPH的发病机制提供了新的思路，为HPH的治疗提供了新的靶点。
　　第一部分 MicroRNA在低氧性肺动脉高压大鼠模型肺组织表达谱分析
　　目的:
　　检测HPH与常氧对照组大鼠肺组织中差异性表达的microRNA。
　　方法:
　　首先构建HPH大鼠模型，通过右心室压力测定(RVSP)、右心肥厚指数(RVHI)计算及HE染色确定HPH模型构建是否成功。采用microRNA芯片技术检测HPH与常氧对照组大鼠肺组织中microRNA的表达谱，通过real-time PCR对芯片结果进行验证，最后运用生物信息学方法对芯片结果进行分析，以筛选可能与HPH相关的microRNA。
　　结果:
　　1.芯片杂交结果经分析后显示，有51种microRNA在HPH模型大鼠肺组织中异常表达，其中表达上调的有26个(p＜0.001)，表达下调的25个(p＜0.001)。选取5个microRNA: miR-218，miR-26a，miR-34a，miR-98，miR-203进行real-timePCR验证，结果示real-time PCR中microRNA的变化方向及程度与芯片高度一致;
　　2.GO分析显示，HPH大鼠肺组织与对照组差异性表达microRNA的高富集度的靶基因功能包括多种，涉及细胞的生长、分化、凋亡等。其中上调microRNA的高富集度靶基因功能包括钙离子感受、DNA结合、细胞器成分等，下调microRNA的高富集度靶基因功能包括细胞增殖、细胞信号传导、磷酸酶活性调节等。
　　小结:
　　与对照组相比，HPH大鼠肺组织中有26个microRNA表达上调，25个microRNA表达下调，通过GO分析HPH大鼠肺组织与常氧对照组差异性表达的microRNA的高富集度靶基因功能涉及细胞的生长、分化、凋亡。
　　第二部分 MiR-218在低氧处理的大鼠PASMC s中的表达及其对PASMCs增殖、迁移及凋亡的影响研究
　　目的:
　　检测miR-218在低氧处理的大鼠PASMCs中的表达及其对PASMCs增殖、迁移及凋亡的影响。
　　方法:
　　首先用酶联合消化法原代培养大鼠PASMCs并鉴定，用real-time PCR检测低氧处理的PASMCs中miR-218的表达。在PASMCs中通过转染miR-218-Mimic和miR-218-Inhibitor分别过表达和抑制miR-218，转染miR-NC作为阴性对照，分别利用CCK-8和EdU法、划痕实验、流式法检测其对PASMCs增殖、迁移、凋亡的影响。
　　结果:
　　1.低氧24h及48h后，PASMCs中miR-218的表达均显著低于常氧对照组(P＜0.01);
　　2.相比转染miR-NC组，CCK-8实验结果示:转染miR-218-Mimic组OD值显著降低，转染miR-218-Inhibitor组OD值显著升高(P＜0.05);EdU实验结果示:转染miR-218-Mimic组增殖期细胞比例明显降低，而转染miR-218-Inhibitor组增殖期细胞比例明显增高(P＜0.05);划痕实验结果示:转染miR-218-Mimic组转染24h后划痕宽度明显大于转染miR-NC组，转染miR-218-Inhibitor组24h后划痕宽度明显小于转染miR-NC组(P＜0.05);流式细胞仪检测三组间凋亡细胞比例，结果示:3组间细胞凋亡比例无统计学差异(P＞0.05)。
　　小结:
　　MiR-218在低氧处理的PASMCs中表达降低，miR-218可以抑制PASMCs的增殖、迁移而不影响其凋亡。
　　第三部分 MiR-218通过抑制PERK在低氧性肺动脉高压中作用研究
　　目的:
　　预测miR-218靶基因并进行验证。
　　方法:
　　利用生物信息学网站预测miR-218可能的靶基因，在PASMCs中转染miR-218-Mimic，转染miR-NC作为对照，通过荧光定量PCR检测miR-218可能的靶基因表达量进行初步筛选;在HPH大鼠肺组织中利用Western Blot检测miR-218可能的靶基因PERK的表达;构建pgl-promoter+PERK3'UTR质粒，与miR-218-Mimic、Renilla质粒共同转染入293细胞中，共同转染miR-NC作为对照，利用双荧光素酶报告基因检测转染miR-218-Mimic后荧光素酶活性;在PASMCs中转染miR-218-Mimic，转染miR-NC作为对照，利用Western Blot检测PERK的表达。
　　结果:
　　1.生物信息学网站预测结合文献筛选miR-218可能的靶基因为PERK、APAK12、TRPC1，荧光定量PCR结果示PERK在转染miR-218-Mimic的PASMCs中表达降低;
　　2.Western Blot结果示PERK在HPH大鼠肺组织中表达增高;
　　3.转染miR-218-Mimic组的荧光素酶活性明显低于转染miR-NC组，(P＜0.01)。Western Blot结果示转染miR-218-Mimic的PASMCs中PERK表达明显低于转染miR-NC组。
　　小结:
　　低氧通过抑制miR-218而激活PERK参与HPH的发生。
　　第四部分特异性抑制miR-218靶基因PERK对HPH大鼠模型的作用研究
　　目的:
　　检测miR-218靶基因PERK的特异性抑制剂GSK2656157对HPH大鼠模型的作用。
　　方法:
　　将18只SD大鼠随机分为常氧对照组(N-control)、低氧对照组(H-control)、低氧干预组(H+PERK Inhibitor)，三组大鼠分别经过常氧饲养21天、低氧饲养21天、低氧饲养21天+口服PERK抑制剂GSK2656157 bid21天后，经颈外静脉插管测RVSP，留取心脏组织计算RVHI，肺组织经福尔马林固定后，常规石蜡包埋，HE染色、EVG染色、α-SMA免疫组化，显微镜下观察肺血管重塑情况，计算肺血管重塑指标WT％及肌型动脉百分比。
　　结果:
　　1.H-control组RVSP明显高于N-control组(38.56±2.67 VS26.20±1.85，P＜0.05)，H+PERK Inhibitor组RVSP明显低于H-control组（38.56±2.67 VS31.05±2.05，P＜0.05）。H-control组RVHI明显高于N-control组（0.26±0.02 VS0.4±0.02，P＜0.05），H+PERK Inhibitor组RVHI明显低于H-control组（0.4±0.02 VS0.31±0.02，P＜0.05）;
　　2.HE染色，与N-control组相比，H-control组肺小血管中膜平滑肌层明显增厚，管腔狭窄，管周炎细胞浸润，H+PERK Inhibitor组肺小血管中膜平滑肌层增厚不明显。EVG染色，N-control组肺肌型小动脉具有内外双层弹力纤维及薄的肌肉层，H-control肺肌型动脉中膜平滑肌层显著增厚，且外层弹力纤维结构显示不清，H+PERK Inhibitor组肺肌型动脉厚度较H-control组明显回落，外层弹力纤维结构可见。α-SMA免疫组化，肺肌型动脉中膜平滑肌被染成棕黄色，与N-control组相比，H-control组肺小动脉中膜厚度明显增加，H+PERK Inhibitor组肺小动脉中膜厚度较H-control组明显回落;
　　3.H-control组WT％明显高于N-control组(49.53±5.54％ VS20.08±3.24％，P＜0.01)，H+PERK Inhibitor组WT％明显低于H-control组（32.47±4.05％ VS49.53±5.54％，P＜0.05）;H-control组肌型小动脉百分比明显高于N-control组（58.09±6.24％ VS37.76±4.55％，P＜0.01），H+PERK Inhibitor组肌型小动脉百分比明显低于H-control组（58.09±6.24％ VS47.57±5.22％，P＜0.05）
　　小结:
　　特异性抑制miR-218靶基因PERK可以有效降低低氧引起的肺动脉压力增高，改善肺血管重塑。

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致谢

摘要

缩写词表

绪论

第一部分 MicroRNA在低氧性肺动脉高压大鼠模型肺组织表达谱分析

1 前言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

5 小结

第二部分 MiR-218在低氧处理的大鼠PASMC s中的表达及其对PASMCs增殖、迁移及凋亡的影响研究

1 前言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

5 小结

第三部分 MiR-218通过抑制PERK在低氧性肺动脉高压中作用研究

1 前言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

5 小结

第四部分 特异性抑制miR-218靶基因PERK对HPH大鼠模型的作用研究

1 前言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

5 小结

结论与展望

参考文献

综述 低氧激活未折叠蛋白反应PERK通路在疾病中的作用研究进展

作者简介及学习期间所取得的科研成果