西瓜枯萎病菌蛋白质二硫键异构酶(PDI)家族基因在致病性中的功能研究

摘要

枯萎病(Fusarium wilt disease)是西瓜上的一种重要真菌病害，严重威胁着西瓜产业的可持续发展。该病的病原菌为尖孢镰刀菌西瓜专化型（Fusarium oxysporum f.spniveum），但目前对该病原菌有关致病性机制的研究相对有限。本文重点研究了西瓜枯萎病菌中蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase，PDI)家族基因在致病性中的功能及其可能的作用机制。
　　通过生物信息学分析并结合PCR扩增克隆测序，鉴定到西瓜枯萎病菌基因组中6个PDI家族基因，分别为Fon00140、Fon08535、Fon01620、Fon08898、Fon18919和Fon05843。通过原生质体转化介导的基因敲除技术，获得了Fon00140、Fon08535、Fon01620、Fon08898、Fon18919这5个基因的缺失突变体和Fon00140、Fon08535基因的回补菌株;通过比较突变体与野生型菌株在生长速率、致病力、分生孢子的数量和形态、不同环境胁迫压力和胞外水解酶的差异，初步探究了这5个基因的生物学功能。结果如下:
　　1.通过对菌丝生长、产孢和孢子萌发率以及致病性等方面的测定，西瓜枯萎病菌中的Fon01620、Fon08898和Fon18919基因的缺失并不影响西瓜枯萎病菌上述性状。在胁迫压力测定中，各个基因缺失突变体的敏感性表型各不相同，但存在一些共性，包括对细胞壁胁迫因子SDS、渗透压胁迫因子Sorbitol、氧化胁迫因子Paraquat、金属离子胁迫CaCl2的敏感性增加，对金属离子胁迫MgCl2的抗性增加。
　　2.对西瓜枯萎病菌中Fon0014和Fon08535基因的功能研究发现，Fon00140基因的缺失不影响西瓜枯萎病菌菌落形态，但会影响色素合成。而Fon08535基因的缺失会影响西瓜枯萎病菌的气生菌丝生长和色素合成。同时△Fon00140、△Fon08535的产孢量显著大于野生型WT，分生孢子形态明显发生改变。
　　3.在胁迫压力测定中，两个基因缺失突变体△Fon00140和△Fon08535的敏感性表现各不相同，但渗透压胁迫因子NaCl和Sorbitol都能够促进△Fon00140和△Fon08535菌株的生长。
　　4.Fon00140和Fon08535基因的缺失突变体△Fon00140和△Fon08535，菌株对西瓜的致病能力显著降低，玻璃纸穿透实验发现菌株丧失穿透能力，菌丝蔓延在根部表面生长而极少穿透进入，这可能是导致其致病性下降的关键因素。同时，突变体中FA合成相关基因簇中重要的3个基因（FUB1、FUB4、FUB10）的表达下调，这可能也是影响其致病性的重要因素。
　　5.进一步研究发现△Fon00140、△Fon08535突变体所产生的胞外水解酶含量显著下降，其中包括蛋白质水解酶，纤维素水解酶和果胶酶，这说明Fon00140和Fon08535基因会影响西瓜枯萎病菌胞外酶的含量。
　　本研究结果表明，Fon00140、Fon08535基因影响西瓜枯萎病菌的致病力，并对西瓜枯萎病菌的生长发育、不同环境胁迫响应和胞外水解酶的分泌有着重要的作用，而Fon01620、Fon08898、Fon18919基因不参与西瓜枯萎病菌的致病过程。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 文献综述及研究背景

1．1 西瓜枯萎病概述

1．1．1 病害特征

1．1．2 病害菌以及病害循环

1．1．3 西瓜枯萎病病原菌生理小种分化

1．2 西瓜枯萎病菌侵染机制研究进展

1．2．1 致病相关基因

1．2．2 真菌毒素

1．2．3 胞外水解酶

1．3 PDI基因家族及其功能

1．3．1 PDI的结构特征与家族成员

1．3．2 PDI的生物学功能

1．4 本研究的目的意义与主要内容

1．4．1 研究的目的与意义

1．4．2 研究的主要内容

第二章 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌株

2．1．2 试供西瓜品种

2．1．3 生化试剂与实验耗材

2．2 实验方法

2．2．1 菌株的培养和保存

2．2．2 西瓜枯萎病菌基因组DNA小量提取

2．2．3 CTAB法提取西瓜枯萎病菌基因组DNA

2．2．4 PCR技术

2．2．5 DNA琼脂糖凝胶电泳

2．2．6 DNA克隆与载体构建

2．2．7 基因的敲除、回补与验证

2．2．8 PEG介导的西瓜枯萎病菌原生质体转化

2．2．9 DNA Southern blot分析

2．2．10 西瓜枯萎病菌RNA的提取

2．2．11 cDNA的合成

2．2．12 实时荧光定量PCR

2．2．13 西瓜枯萎病菌的生物学特性分析

2．2．14 西瓜枯萎病菌致病性实验

2．2．15 西瓜枯萎病菌的扫描电镜观察

2．2．16 西瓜枯萎病菌胞外酶活测定

第三章 结果与分析

3．1 西瓜枯萎病菌PDI基因的鉴定及突变体的构建

3．1．1 西瓜枯萎病菌PDI基因的鉴定

3．1．2 突变体的构建

3．2 西瓜枯萎病菌PDIs的功能分析

3．2．1 PDIs基因缺失突交体的菌落形态

3．2．2 PDIs基因参与调控西瓜枯萎病菌的无性繁殖

3．2．3 PDIs基因参与西瓜枯萎病菌响应环境胁迫

3．2．4 Fon00140和Fon08535基因参与西瓜枯萎病菌的致病性

3．2．5 Fo00140和Fo08535基因影响西瓜枯萎病菌的侵染能力和次级代谢物质的合成

3．2．6 Fon00140和Fon08535基因影响西瓜枯萎病菌的胞外酶

第四章 讨论

第五章 小结与展望

5．1 全文小结

5．2 后续工作展望

参考文献

附录