双生病毒复制相关寄主因子及其卫星DNAβ复制顺式作用元件鉴定和功能分析

摘要

双生病毒是一类在世界范围内广泛发生的植物单链环状DNA病毒，其中菜豆金色花叶病毒属病毒(begomoviruses)种类最多，危害最为严重。双生病毒通过编码的复制相关蛋白Rep招募寄主DNA复制机器，在侵染的植物细胞核内以滚环复制模式进行基因组复制，但该过程涉及的寄主因子及其功能尚缺乏深入研究。此外，begomoviruses通常伴随有一类基因组大小约为辅助病毒一半的卫星分子，称为betasatellite。辅助病毒与betasatellite的复合侵染常常是引起重要病害症状的原因。为了更好地探究双生病毒复制及致病的机理，以及了解begomoviruses伴随betasatellite的复制、进化分子机制，本文筛选了与菜豆金色花叶病毒属病毒复制相关蛋白Rep互作的寄主因子并鉴定了betasatellite复制顺式作用元件，取得了以下研究结果:
　　1.Begomoviruses伴随的betasatellite复制相关顺式作用元件的鉴定及制机理研究
　　Begomoviruses可反式复制同源或异源betasatellites，其复制缺乏显著的特异性;但当同源及异源的卫星共同存在时，辅助病毒倾向于复制和维持同源卫星，但其机理尚不清楚。前期研究发现，辅助病毒对同源卫星的复制选择性是由卫星DNA分子中一段与同源辅助病毒Rep特异性结合的序列元件(Rep binding motif，RBM)决定。序列分析发现，TbCSB RBM序列中存在两个串联的重复子(iteron)样的顺式元件GAGGACC，推测其与Rep的结合以及卫星的复制相关。竞争性EMSA试验以及iterons突变和置换分析发现，TbCSB RBM内重复子元件介导与TbCSV Rep的高亲和性结合。本氏烟侵染试验及叶盘复制试验发现，TbCSB重复子对于卫星的反式复制具有重要作用，且3'-重复子对于复制起关键作用，而5'-重复子能够增强TbCSB的复制。构建了TYLCCNB和TbCSB的重复子互换突变体，侵染性克隆接种实验发现，betasatellite内的重复子序列是决定辅助病毒对同源卫星选择性复制的关键元件。利用基于指数富集的配体系统进化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment，SELEX)分析发现，TbCSV Rep体外筛选得到的卫星DNA配体序列中均含有与野生型重复子高度相似的保守序列GGACC或GAACC，且这些配体序列与Rep具有很高的结合亲和性。序列比对分析发现，betasatellites中的重复子序列与辅助病毒基因组DNA内的重复子序列在位置、大小及序列上具有高度的保守性。突变分析表明，辅助病毒重复子序列也是其复制所必需的。进一步大规模序列分析发现，多种双生病毒/卫星病害复合体均存在一致的重复子序列。这些结果表明，betasatellite在长期的进化过程中获得了与辅助病毒类似的重复子序列，以适应辅助病毒介导的高效复制。本研究首次报道了betasatellite需要与辅助病毒同源的重复子进行高效复制，解释了困扰学界的卫星复制专化性机制的疑问，同时为双生病毒/卫星病害复合体的起源，进化和流行提供新的见解。
　　2.与莱豆金色花叶病毒属病毒复制相关蛋白Rep互作的本氏烟寄主因子筛选和功能研究
　　双生病毒侵染已成熟的寄主植物细胞后，通过复制相关蛋白(Replicationprotein，Rep)与寄主细胞的蛋白互作，从而激活细胞周期，营造有利于病毒复制的细胞环境。为了更深入探究双生病毒复制机理，我们利用酵母双杂交文库筛选与中国番茄黄化曲叶病毒（Tomatoyellow leaf curl China virus-Y10，TYLCCNV）和烟草曲茎病毒（Tobacco curly shoot virus-Y35，TbCSV）Rep互作的本氏烟寄主因子，共得到15个互作的蛋白。利用TRV沉默寄主因子表达，发现其中铁氧还蛋白FerredoxinⅠ(NbFdnⅠ)表达下调后，本氏烟植株表现出褪绿黄化的表型。NbFdnⅠ沉默植株接种TbCSV后，病毒引起的症状大大减轻，病毒复制积累量也显著降低，表明NbFdnⅠ参与了TbCSV侵染复制过程。NbFdnⅠ参与光合作用中电子链传递，亚细胞定位研究发现，其定位于叶绿体表面。表达分析发现，NbFdnⅠ在双生病毒TbCSV单独侵染时表达量上调，但当TbCSV与伴随的betasatellite(TbCSB)存共同侵染时，NbFdnⅠ转录反而显著下调。前期研究发现，当TbCSV单独侵染时，JA的受体COI1转录明显上调，而在有TbCSB共同侵染时，COI1被显著下调。为了验证COI1与NbFdnⅠ响应TbCSV侵染的关系，我们利用TRV沉默下调NbFdnⅠ时，发现COI1的转录被显著下调，暗示NbFdnⅠ能够调控COI1基因的转录而调控JA抗病毒反应。进一步的研究发现，βC1即为抑制NbFdnⅠ表达的关键因子。
　　3.印度绿豆黄化花叶病毒复制相关酵母寄主因子鉴定及编码的AC5基因功能研究
　　我们构建了印度绿豆黄化花叶病毒（Mungbeanyellow mosaic India virus，MYMIV)的酵母复制载体，分别转化酵母菌株BY4741和W303-1B，发现MYMIV能在酵母中复制。进一步利用酵母必需基因温度敏感型突变体库，筛选了787个温度敏感型突变体酵母菌株，通过适宜温度、半致死温度以及营养缺陷筛选，获得了131个影响MYMIV复制的酵母寄主因子。分析发现，这些寄主因子涉及DNA复制、DNA损伤修复、细胞分裂周期、Pre-mRNA加工等生物学途径。对MYMIV基因组不同长度的插入及突变分析发现，MYMIV在酵母体内的复制模式并非经典的滚环复制(rolling circle replication，RCR)。
　　利用MYMIV酵母复制系统，对AC5基因进行突变分析发现，MYMIV-AC5m无义突变体在酵母中的复制效率大大降低，且在绿豆寄主上引起的黄化、花叶症状减轻。Southern blot检测发现，AC5突变体可系统侵染试验寄主本氏烟，但DNA积累量降低;进一步本氏烟叶盘复制试验发现，AC5m导致MYMIV DNA-A复制积累量降低，说明AC5基因对于MYMIV复制虽然并非必需，但能显著增强复制。PVX过表达AC5发现能引起活性氧积累而导致细胞坏死;AC5转基因本氏烟具有植株矮小、开花延迟的表型，且AC5转基因能显著增强MYMIV的毒性，说明AC5是一个症状决定因子。进一步研究发现AC5能抑制sense-RNA介导的转录后水平基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS），且能抑制DOMAINS REARRANGAED METHYTRANSFERASE2(DRM2)的转录从而抑制寄主的转录水平基因沉默（transcriptional gene silencing，TGS）抗病毒反应。

目录

声明

致谢

摘要

1 研究背景

1．1 双生病毒的发生和危害

1．2 双生病毒的分类和基因组结构

1．3 双生病毒的侵染

1．3．1 双生病毒复制的细胞环境

1．3．2 双生病毒复制相关结构域

1．3．3 双生病毒的复制循环

1．3．4 双生病毒编码的Rep蛋白的结构和功能

1．3．5 与Rep互作的病毒蛋白及寄主因子

1．4 Begomoviruses的传播及在介体中的增殖复制

1．5 双生病毒的致病机理

1．6 模式寄主酵母在双生病毒复制研究中的运用

1．7 单组份Begomovirus伴随的betasatellite

1．7．1 Betasatellite的基因组结构

1．7．2 Betasatellite参与病害症状的形成

1．7．3 Betasatellite抑制转录后水平基因沉默(PTGS)

1．7．4 Betasatellite抑制转录水平基因沉默(TGS)

1．7．5 Betasatellite参与双生病毒的运动

1．7．6 Betasatellite参与对寄主防卫反应的抑制

1．8 Betasatellites的复制

1．9 Betasateilite的起源与进化

1．10 基于指数富集的配体系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment，SELEX)

1．11本项目的研究目的和意义

2 实验方法

2．1 常规DNA克隆技术

2．1．1 聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)技术

2．1．2 PCR产物的纯化

2．1．3 质粒载体的去磷酸化

2．1．4 载体连接

2．1．5 感受态细胞的制备

2．1．6 大肠杆菌的转化

2．1．7 菌落PCR筛选鉴定

2．1．8 大肠杆菌质粒提取

2．1．9 重组质粒的酶切验证

2．1．10 重组质粒的测序分析

2．2 根癌农杆菌转化及农杆菌介导的植物接种

2．2．1 根癌农杆菌感受态细胞的制备

2．2．2 重组质粒电击转化根癌农杆菌

2．2．3 根癌农杆菌的浸润接种

2．3 植物总DNA提取及Southern blot分析

2．3．1 植物总DNA大量抽提

2．3．2 植物总DNA小量抽提

2．3．3 植物总DNA小量抽提(试剂盒法)

2．3．4 Southern blot杂交分析

2．4 植物总RNA提取及荧光定量PCR

2．4．1 植物总RNA小量提取

2．4．2 反转录RT-PCR和RT-qPCR

2．5 植物总蛋白的提取、蛋白的SDS-PAGE电泳及Western blot印记分析

2．5．1 植物总蛋白的提取

2．5．2 蛋白的SDS-PAGE电泳及Western blot印记分析

2．6 蛋白的原核表达及纯化

2．6．1 常用的原核表达系统

2．6．2 融合蛋白的原核表达

2．6．3 原核表达蛋白的纯化

2．7 凝胶阻滞试验(EMSA-electrophoretic mobility shift assay)

2．8 指数富集的配体系统进化技术(SELEX)

3 Begomoviruses伴随的betasatellite复制相关顺式作用元件的鉴定及复制机理研究

3．1 实验材料与方法

3．1．1 植物材料

3．1．2 病毒材料

3．1．3 DNAβ RBM相关突变体侵染性克隆的构建

3．1．4 农杆菌介导的植物接种

3．1．5 接种植株中病毒的检测

3．1．6 Y10Rep和Y35Rep的原核表达

3．1．7 Y10Rep和Y35Rep的纯化

3．1．8 凝胶阻滞试验(EMSA)

3．1．9 叶盘复制实验

3．1．10 指数富集的配体系统进化技术(SELEX)

3．2 结果与分析

3．2．1 卫星DNAβ中的RBM序列决定了DNAβ的复制效率及专化性

3．2．2 卫星DNAβ RBM中的iterons序列影响了DNAβ的复制与侵染

3．2．3 DNAβ RBM中的iterons序列决定了DNAβ被辅助病毒复制的选择性

3．2．4 RBM中iterons决定了DNAβ与辅助病毒Rep亲和结合的特异性和强度

3．2．6 TbCSB RBM中iterons碱基序列的排列及偏好性

3．2．7 SELEX体外研究DNAβ的遗传进化

3．2．8 Y35β RBM中复制核心元件的鉴定

3．2．9 DNAβ与辅助病毒iterons的关系

3．2．10 TbCSV-Y35 iterons序列是病毒复制必需的顺式元件

3．3 讨论

4 与begomovirus复制相关蛋白Rep互作的本氏烟寄主因子筛选和功能研究

4．1 实验材料与方法

4．1．1 实验材料

4．1．2 试验方法

4．2 结果与分析

4．2．2 与Y10AC1、Y35AC1、MYMIV-AC1互作的本氏烟寄主因子筛选

4．2．3 TRV沉默分析部分本氏烟寄主因子对TbCSV复制的影响

4．2．4 酵母双杂交验证Ferredoxin I与诱饵蛋白的互作

4．2．5 BiFC验证NbFdn Ⅰ与Y35AC1的互作

4．2．6 GST pull-down验证NbFdn Ⅰ与Y35AC1之间的互作

4．2．7 NbFdn Ⅰ的亚细胞定位及对双生病毒侵染的响应

4．2．8 NbFdn Ⅰ对TbCSV-Y35病毒侵染的影响

4．3 讨论

5 印度绿豆黄化花叶病毒复制相关酵母寄主因子鉴定及编码的AC5基因功能研究

5．1 实验材料和方法

5．1．1 实验材料

5．1．2 载体构建

5．1．3 温度敏感型酵母突变体转化

5．1．4 温度敏感型酵母突变体库筛选理论依据

5．2 结果与分析

5．2．1 MYMIV DNA-A能在酵母中复制

5．2．2 影响MYMIV复制的酵母寄主因子筛选

5．2．3 MYMIV在酵母中复制模式的研究

5．2．4 MYMIV编码的AC5基因功能分析

5．3 讨论

6 全文小结

参考文献

附录

作者简历及攻读博士学位期间发表的学术论文