光酶诱导桑叶中Diels-Alderase的分离鉴定及克隆表达研究

摘要

桑科植物在全世界范围内共有37个属1100个物种，其中人们熟知的有桑树，面包树，见血封喉等。桑叶是桑属植物桑（Morus alba L.）的叶片，是家蚕的主要食物来源。除此之外，桑的叶、果实和根皮都是常用中药，在降血糖、滋补、治疗外感风热、咳嗽咳喘方面疗效显著。研究组前期研究发现光酶诱导后桑叶中的moracin C，moracin N，morachalcone，guangsangon E和chalcomoracin含量显著增加:其中chalcomoracin桑树特有的一类Diels-Alder型加合物，在桑树根皮中微量存在，偶尔在桑叶中分离得到，具有显著的抗氧化、抗病毒、抑菌、抗肿瘤和降血糖生物活性。Chalcomoracin结构复杂，有三个手性中心，化学合成得率很低，虽然光酶诱导后的桑叶中chalcomoracin含量显著提高，但桑叶所含化合物成分复杂，叶绿素干扰严重，提取分离成本较高。Diels-Alderase是存在于桑叶中，以moracin C和morachalcone为底物催化合成chalcomoracin的重要酶，本论文以Diels-Alderase的比活力和SDS-PAGE蛋白条带为纯化标准进行检测，对光酶诱导桑叶中chalcomoracin生物合成过程中关键的Diels-Alderase进行分离纯化。本论文的研究结果如下:
　　(1)Diels-Alderase分离纯化的研究。光酶诱导桑叶与100mMpH=7.5的PBS缓冲液按照料液比1∶10的比例混合，破碎后并于4℃浸提2h，12000g4℃离心20min，取上清经硫酸铵分级沉淀收集40-60％组分的蛋白，沉淀用含有0.8M硫酸铵的pH=7.5的PBS缓冲液复溶。通过疏水层析分离;收集30-50％组分;10kDa Centrifugal Filter Units于4500g4℃离心20min超滤置换缓冲液，过阴离子交换层析;取第4管组分超滤浓缩置换缓冲液，过阳离子交换层析;取流穿组分过凝胶过滤层析。纯化倍数增加，比活力显著增加，回收率下降明显，凝胶过滤层析后蛋白纯化倍数达25.29倍，蛋白回收率仅为0.04％。获得的高纯度蛋白为目标蛋白的解析奠定了基础。
　　(2)光酶诱导桑叶中Diels-Alderase的鉴定及克隆表达研究。基于LC-MS/MS的Diels-Alderase肽段序列鉴定，共得到27个候选蛋白。通过对蛋白条带的MALDI-TOF/TOF鉴定，比对桑叶转录组数据库，最终发现具有Diels-Alderase催化功能的蛋白可能为chloroplast sedoheptulose-1，7-bisphosphatase（SBPase:景天庚1，7-二磷酸酶）。SBPase开放阅读框长度为1179bp，含有392个氨基酸，预测分子量大小为42521.55Da，等电点为5.96。应用pET-19b载体，对SBPase进行克隆表达，表达菌株为BL21;SDS-PAGE结果表明在37℃，1mM IPTG诱导4h时，有大量可溶性重组蛋白的表达。对重组蛋白进行活性验证显示:在FAD存在条件下，重组蛋白可非高效催化moracinC和morachalcone生成chalcomoracin。
　　本论文从光酶诱导桑叶中分离出电泳纯的Diels-Alderase，经MALDI-TOF/TOF和LC-MS/MS鉴定分析得到候选蛋白的氨基酸序列。并应用原核表达系统对疑似目标蛋白进行体外表达，并进行了活性验证。确定了桑叶Diels-Alderase的筛选范围，为chalcomoracin生物合成途径的研究和chalcomoracin生物合成途径中关键酶Diels-Alderase的结构生物学研究奠定基础。

目录

声明

致谢

摘要

缩写表

第一章 绪论

1．1 光酶诱导技术提高植物次生代谢产物含量的研究进展

1．2 Chalcomoracin研究进展

1．2．1 Chalcomoracin的药理作用

1．2．2 Chalcomoracin的生物合成

1．3 Diels-Alderase的研究进展

1．3．2 Diels-Alderase研究现状

1．4 本论文的研究内容与意义

第二章 光酶诱导桑叶中Diels-Alderase的分离纯化

2．1 引言

2．2 实验材料

2．2．1 实验材料与试剂

2．2．2 主要仪器

2．3 实验方法

2．3．2 蛋白浓度测定

2．3．3 酶促反应及酶活检测

2．3．4 SDS-PAGE电泳分析蛋白纯化效果

2．3．5 不同处理组桑叶叶绿体中chalcomoracin含量测定

2．3．6 蛋白纯化条件

2．3．7 Gel Filtration Calibration Kits预测目标蛋白分子量范围

2．4 实验结果

2．4．1 不同处理桑叶叶绿体中Chalcomoracin含量

2．4．2 光酶诱导桑叶中Diels-Alderase的分离纯化

2．4．3 蛋白纯化策略

2．4．4 Gel Filtration Calibration Kits预测目标蛋白分子量范围

2．5 讨论

2．5．1 实验材料的选择

2．5．2 叶绿体中chalcomoracin含量

2．5．3 蛋白纯化策略

2．5．4 目标蛋白分子量预测

2．6 本章小结

第三章 具有Diels-Alderase催化活性的目标蛋白质谱鉴定及氨基酸序列分析

3．1 引言

3．2 实验材料

3．2．1 实验材料与试剂

3．2．2 实验仪器

3．3 实验方法

3．3．2 MALDI-TOF／TOF蛋白鉴定

3．4 实验结果

3．4．1 LC-MS／MS鉴定结果

3．4．2 MALDI-TOF／TOF鉴定结果

3．4 讨论

3．5 本章小结

4．1 引言

4．2 实验材料

4．2．1 实验材料与试剂

4．2．2 实验仪器

4．3 实验方法

4．3．1 溶液和培养基

4．3．2 目的序列的获取

4．3．3 SBPase基因原核表达载体的构建

4．3．4 SBPase在大肠杆菌中的表达

4．3．6 SBPase的Diels-Alderase活性验证

4．4 实验结果

4．4．1 以pET-19b为载体对SBPase基因进行原核表达

4．4．2 SBPase催化Diels-Alder反应的活性

4．5 讨论

4．5．1 重组蛋白活性鉴定

4．6 本章小结

5．1 总结

5．2 展望

附表

参考文献

作者简介