拟穴青蟹核转录因子κB抑制因子激酶基因克隆与鉴定及其在生物和非生物胁迫下的表达谱分析研究

摘要

先天性免疫系统是机体抵御病原体入侵的第一道防线。无脊椎动物由于缺乏适应性免疫系统而主要依赖于先天性免疫系统。核转录因子NF-κB(nuclear factor-κB)是一种普适性存在的、能调节多种炎症和免疫基因表达的一种重要的转录调节因子。NF-κB在无脊椎动物的先天性免疫系统中发挥尤其重要的作用。NF-κB的激活由含特定丝氨酸位点的核因子κB抑制因子激酶IKK(inhibitor ofNF-κB kinase)组成的高分子复合物完成。IKK介导的NF-κB信号通路几乎存在于所有的动物细胞中。然而，蟹类IKK的系统鉴定研究目前尚未见报导。
　　利用RACE方法，本研究首次克隆了三个拟穴青蟹IKK基因的cDNA全长序列，分别命名为SpIKKβ，SpIKKε1和SpIKKε2。氨基酸序列多重比较结果表明所有SpIKK都包含IKK功能所需的保守残基和重要功能域，如激酶结构域和亮氨酸拉链基序。进化树分析显示SpIKKβ归于IKK一类，而两个SpIKKε则在IKK相关激酶分支中。胞内定位结果显示，SpIKKβ和SpIKKε1在主要分布在细胞质中，而SpIKKε2仅位于细胞质中。实时荧光定量PCR结果表明三个IKK基因在蟹的血淋巴中均为高表达，而当蟹受到生物胁迫(溶藻弧菌或poly(I∶C)刺激）或非生物胁迫（镉或干露处理）时，三个SpIKK基因的表达谱并不一致，表明三者在应对外界的病原、重金属或干露胁迫下可能扮演不同的角色。双荧光素酶报告结果表明来自蟹的IKK能显著地激活哺乳动物的NF-κB信号通路，说明IKK在激活NF-κB信号通路的功能在进化上具有高度保守性。上述结果暗示SpIKK在拟穴青蟹应对外界生物或非生物胁迫中发挥重要作用，表明IKK在甲壳类动物到哺乳类动物的先天性免疫系统中具有功能保守性。本研究为节肢动物甚至是无脊椎动物中IKK基因的起源与进化提供新的视角。

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致谢

摘要

缩略词表

1 文献综述

1．1 拟穴青蟹生物学特性

1．1．1 群体分类

1．1．2 地理分布

1．1．3 生活习性

1．1．4 国内蟹类养殖的瓶颈

1．2 蟹类病害的研究进展

1．2．1 蟹类常见的致病菌

1．2．2 蟹类养殖中的干露胁迫

1．2．3 蟹类养殖中的重金属胁迫

1．3 无脊椎动物的先天性免疫

1．4 甲壳动物的NF-κB信号通路

1．5 IKK的简单介绍

1．5．1 传统IKK激酶的结构

1．5．2 非传统IKK激酶的结构

1．5．3 依赖IKK复合体降解IκB的NF-κB信号途径

1．5．4 IKK的NF-κB非相关性功能

1．5．5 IKK的激活与抑制

1．5．6 IKK信号通路与疾病的关系

1．6 本项目研究目的与意义

2 实验材料及方法

2．1 实验材料及仪器设备

2．1．1 实验动物

2．1．2 主要化学试剂

2．1．3 主要试剂配制

2．1．4 主要仪器设备和耗材

2．2 实验方法

2．2．1 目的基因cDNA全长的获得

2．2．2 目的基因的序列分析

2．2．3 重组质粒的构建

2．2．4 亚细胞定位

2．2．5 双萤光素酶报告基因实验

2．2．6 实时荧光定量PCR

2．2．7 数据分析

3 实验结果

3．1 目的基因cDNA的克隆与序列分析

3．1．2 SpIKKε基因cDNA全序列

3．1．3 SpIKK基因的生物信息学分析

3．2 SpIKKs的亚细胞定位

3．3 SpIKKs基因的组织表达

3．4 生物类刺激后SpIKKs的mRNA水平变化

3．5 非生物类刺激后SpIKKs的mRNA水平变化

3．5．1 干露刺激后SpIKKs的mRNA水平变化

3．5．2 镉刺激后SpIKKs的mRNA水平变化

3．6 双萤光素酶报告基因实验

4 讨论

4．1 SpIKKs基因序列及结构

4．3 SpIKKs的细胞内定位

4．5 不同刺激下SpIKKs基因的表达交化

4．5．1 生物类刺激下SpIKKs基因的表达变化

4．5．2 非生物类刺激下SpIKKs基因的表达变化

4．6 SpIKKs激活NF-κB通路

5 小结

参考文献

作者简历