miR--969与Sin3A分别调控果蝇运动神经元功能和Notch信号通路的分子机制研究

摘要

本论文中第一部分主要论述了miR-969在果蝇运动神经元中表达及调控运动行为的分子机制。miR-969在果蝇胚胎、幼虫、成虫期运动神经元均有集中表达。当敲除miR-969时，突变体展现了攀爬能力变弱的表型。用D42/OK371/miR-969自身等在运动神经元中特异性表达的gal4去表达miR-969sponge，敲低miR-969表达，后代果蝇也展现出攀爬能力变弱的表型。我们运用生物信息学方法，找到两个潜在的靶基因Pak3和kay。在miR-969突变体中敲低Pak3和kay基因表达，可以拯救突变体攀爬表型。使用双荧光素酶报告基因的方法验证了miR-969可以直接调控kay基因3'UTR。这些结果说明miR-969通过在运动神经元中表达，负调控靶基因kay的表达来影响果蝇的运动行为。 本论文第二部分主要论述了Sin3A参与调控Notch信号通路。当敲低Sin3A表达时，Notch信号通路的下游靶基因cut，wg，E(spl)m8，Su(H)等表达均下降。敲低Sin3A表达会使后代果蝇翅膀产生缺刻的表型。过表达Delta不能拯救敲低Sin3A导致的Notch信号通路下游靶基因表达下降的结果，但是过表达Notch可以拯救下游靶基因表达下降。敲低Sin3A会导致Notch基因的转录水平下降。这些结果说明Sin3A在Notch基因上游位置，通过正调控Notch基因转录水平发挥作用。

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致谢

摘要

第一章绪论

1．1模式生物果蝇

1．2 GAL4／UAS表达系统

1．3 MicroRNA研究进展

1．4 MicroRNA功能与果蝇神经系统

1．5 Sin3A和Notch信号通路

第二章材料与方法

2．1果蝇株系与杂交果蝇株构建

2．1．1果蝇株系

2．1．2杂交果蝇株构建

2．2 Flip out克隆技术

2．3免疫荧光染色

2．3．1 不同组织的解剖与免疫荧光染色

2．3．2使用抗体列表

2．4果蝇攀爬能力测试

2．5重组质粒构建

2．6大肠杆菌转化及质粒抽提

2．7果蝇S2细胞培养及质粒转染

2．7．1果蝇S2细胞培养

2．7．2果蝇细胞冻存和复苏

2．7．3果蝇S2细胞质粒转染

2．8双荧光素酶报告基因检测

2．8．1 双荧光素酶报告基因检测原理

2．8．2双荧光素酶报告基因检测流程

第三章miR-969在运动神经元表达并调控运动行为

3．1 miR-969在运动神经元中表达

3．2 miR-969突变体成虫攀爬能力减弱

3．3 miR-969突变体表型可以被拯救

3．4 miR-969潜在靶基因预测

3．5敲低Pak3和kay基因表达可以拯救miR-969突变体攀爬表型

3．6 miR-969与潜在靶基因3’UTR双荧光素酶报告基因检测

第四章Sin3A参与调控Notch信号通路

4．1 Sin3A正调控Notch信号通路下游靶基因

4．2 Sin3A在Notch基因上游发挥作用

4．3 Sin3A在转录和蛋白水平调控Notch表达

第五章总结与讨论

5．1 miR-969与运动神经系统

5．2 miR-969调控运动神经元功能的分子机制

5．3 Sin3A参与调控Notch信号通路

参考文献

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