复苏促进因子强化多氯联苯污染土壤微生物修复机制研究

摘要

多氯联苯(Polychlorinated biphenyls，PCBs)是土壤环境中典型的持久性有机污染物，对生态环境与人体健康均构成威胁。PCBs污染土壤的微生物修复具有绿色、低成本的优点，但其修复效率低下的缺点却严重限制了其实际应用。实际土壤中PCBs降解菌处于VBNC(Viable but non-culturable，VBNC)状态可能是影响其效率的重要原因，而部分VBNC状态可以通过复苏促进因子(Resuscitation-promoting factor，Rpf)进行复苏。本文以藤黄球菌（Micrococcus luteus）Rpf和嗜联苯红球菌（Rhodococcus biphenylivoran）TG9作为研究对象，研究了Rpf对TG9的生长及降解联苯(Biphenyls，BP)和PCBs的促进作用，并探索了Rpf促进PCBs污染土壤微生物修复的机制，主要研究结果如下:
　　(1)Rpf能够促进TG9的生长及其对BP/PCBs的降解。藤黄球菌培养上清液(SRpf)、重组Rpf纯化蛋白(PRpf)和重组Rpf蛋白粗提物(LRpf)分别加入TG9培养体系后，均缩短了TG9的延滞期;在BP初始浓度为5000mg/L的条件下，SRpf实验组、PRpf实验组和PRpf实验组在60h的BP降解率分别为73.0％、63.8％和76.7％，显著高于对照组(P＜0.05);在PCBs初始浓度为70mg/L的条件下，SRpf实验组、PRpf实验组和PRpf实验组在60h的PCBs降解率分别为40.8％、52.0％和60.0％，显著高于对照组(P＜0.05);LRpf因具有制备过程简单和有效成分明确的优点，建议在后续研究中仅使用LRpf进行实验。
　　(2)TG9经低温和贫营养条件诱导进入VBNC状态后，其细胞形态和酶活性均发生变化。VBNC状态TG9的细胞形态由短杆状变为球状等，细胞体积变小，细胞质浓缩且细胞壁厚度增加;VBNC状态TG9细胞中的酯酶(C4)、白氨酸芳胺酶、缬氨酸芳胺酶、酚萘-AS-BI-磷酸水解酶、α-葡萄糖甙酶和β-葡萄糖甙酶的活性减弱，但碱性磷酸酶、酸性磷酸酶和类脂酯酶(C8)的活性增强。
　　(3)Rpf对VBNC状态TG9具有复苏作用。VBNC状态的TG9在LRpf加入36h后恢复生长，在BP/PCBs初始分别为5000mg/L和50mg/L的条件下，其60h的降解率分别为29.3％和24.3％，显著高于对照组(P＜0.05)。
　　(4)Rpf基于活性TG9和VBNC状态TG9均可加速土壤中PCBs的微生物降解。Rpf和活性TG9外源加入初始浓度为38.64mg/kg的PCBs污染土壤49d后，PCBs降解率为35.8％，显著高于对照组(P＜0.05);Rpf和经低温贫营养诱导90d的TG9外源加入该土壤49d后，PCBs降解率为34.2％，显著高于对照组(P＜0.05)。
　　(5)Rpf可提高土壤中可培养菌总数，并会影响土壤中微生物的菌群丰度和物种多样性，且能显著提高土壤中Rhodococcus属和Stenotrophomonas属的相对丰度。
　　本文结果有助于进一步揭示复苏促进因子对VBNC状态环境功能菌的作用机制，并为Rpf在土壤有机污染微生物修复中的应用提供理论依据。

目录

声明

致谢

摘要

缩略表

第一章 绪论

1．1 土壤多氯联苯污染现状与微生物修复研究进展

1．1．1 多氯联苯概述

1．1．2 多氯联苯的危害

1．1．3 土壤多氯联苯污染现状

1．1．4 多氯联苯污染土壤微生物修复

1．2 活的但非可培养(VBNC)状态菌研究进展

1．2．1 VBNC状态的发现

1．2．2 VBNC状态菌的形成和生物学特性

1．2．3 VBNC状态与其他“低活性状态”的比较

1．2．4 VBNC状态菌的复苏

1．3 复苏促进因子研究进展

1．3．1 复苏促进因子的发现

1．3．2 复苏促进因子的作用机制

1．3．3 复苏促进因子在环境领域的应用

1．4 研究目的、内容与技术路线

1．4．1 研究目的

1．4．2 研究内容

1．4．3 技术路线

第二章 复苏促进因子对TG9生长及降解BP／PCBs的促进作用研究

2．1 引言

2．2 实验材料、仪器与试剂

2．2．1 实验菌株

2．2．2 培养基及其组成

2．2．3 实验仪器与试剂

2．3 实验方法

2．3．1 复苏促进因子的制备与分析

2．3．2 TG9菌悬液的制备

2．3．3 Rpf对TG9生长及降解BP的促进作用实验

2．3．4 Rpf对TG9生长及降解PCBs的促进作用实验

2．3．5 BP／PCBs的提取与测定

2．4 数据分析

2．5 结果与讨论

2．5．1 Rpf蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

2．5．2 Rpf对TG9生长及降解BP的促进作用

2．5．3 Rpf对TG9生长及降解PCBs的促进作用

2．6 本章小结

第三章 复苏促进因子对VBNC状态TG9复苏及降解BP／PCBs的促进作用研究

3．1 引言

3．2 实验材料、仪器与试剂

3．2．1 实验仪器

3．2．2 实验菌株、培养基和实验试剂

3．3 实验方法

3．3．1 VBNC状态TG9菌悬液的制备

3．3．2 TG9细胞形态的观察

3．3．3 细菌酶活性检测实验

3．3．4 Rpf对VBNC状态TG9的复苏及降解BP的促进作用实验

3．3．5 Rpf对VBNC状态TG9的复苏及降解PCBs的促进作用实验

3．4 数据分析

3．5 结果与讨论

3．5．1 TG9经低温贫营养诱导后形态的变化

3．5．2 TG9酶活性的变化

3．5．3 Rpf对VBNC状态TG9的复苏及降解BP的促进作用

3．5．4 Rpf对VBNC状态TG9的复苏及降解PCBs的促进作用

3．6 本章小结

第四章 复苏促进因子对土壤中多氯联苯微生物降解的促进作用及机制研究

4．1 引言

4．2 实验材料、仪器与试剂

4．2．1 实验中所用到的首剂

4．2．2 实验仪器与试剂

4．3 实验方法

4．3．1 模拟污染土壤的制备

4．3．3 Rpf基于活性TG9促进土壤中多氯联苯微生物降解实验

4．3．4 Rpf基于VBNC状态TG9促进土壤中多氯联苯微生物降解实验

4．3．5 土壤中PCBs的提取与测定

4．3．6 土壤中可培养菌总数的测定

4．3．7 土壤中PCBs降解菌数量的测定

4．3．8 土壤中细菌群落结构的分析

4．4 数据分析

4．5 结果与讨论

4．5．1 模拟污染土壤的性质

4．5．2 Rpf基于土著菌对土壤中多氯联苯微生物降解的促进作用

4．5．3 Rpf基于活性TG9对土壤中多氯联苯微生物降解的促进作用

4．5．4 Rpf基于VBNC状态TG9对土壤中多氯联苯微生物降解的促进作用

4．6 本章小结

5．1 研究结论

5．2 创新点

5．3 研究展望

参考文献

作者简介