小鼠深静脉血栓形成前期PMN和CD8+T细胞对静脉壁浸润的动态研究

摘要

目的：深静脉血栓形成(deep venous thrombosis,DVT)是一种常见疾病，严重威胁人类的健康和生命，其发病率和患病率较高，疗效欠佳，预后不良，发病机制也较为复杂，其后遗症包含肺栓塞及慢性静脉功能不全。随着对血栓性疾病及炎症研究的深入，人们发现血栓形成是一个炎症过程，在血栓形成中必会导致静脉壁炎性细胞浸润，而在其中起主导作用的是早期中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophil，PMN)，也可能正是由于PMN的最早出现，是导致静脉壁损伤的关键因素。活化的PMN通过“呼吸爆发”和脱颗粒作用，产生大量的氧自由基、蛋白颗粒酶以及细胞因子等炎症介质。这些介质构成炎症反应的主要防御环节。较多的研究如选择蛋白类P选择素受体、整合蛋白LFA-1、典型的CXC类趋化细胞因子IL-8及其受体CXCR2，都与血栓形成PMN息息相关。同时采用采用抗中性粒细胞血清来减少体内PMN数量及活性，对血栓及其周围的炎症介质都具有重要的意义。因为PMN在病变过程中随时间的不同，与周围的组织、细胞及炎症介质发生级联反应，不停的改变病变周围的炎症介质含量及功能，从而导致血栓的不同转归。在预实验中，采用小鼠下腔静脉内皮破坏法加缩窄制作深静脉血栓模型， 2d可明确形成血栓，24h及以前时间段可见下腔静脉血液颜色变深，为血栓形成的前期。因此本实验着重于研究PMN在整个血栓形成前期的动态变化，有可能为我们进一步揭示深静脉血栓形成机制。同时，淋巴细胞主要存在于血液中，是机体获得性免疫应答功能的重要细胞成分。T淋巴细胞被激活后转化为淋巴母细胞，并迅速增殖、分化，其中一部分在中途停下不再分化，成为记忆细胞，参与急性排斥反应，本实验同时研究是否有记忆性CD8+T细胞在血栓形成前期也发挥的功能。 方法：1)30只雄性BABL/C小鼠(20-22g)随机分成假手术组(5只)和手术组(25只)。手术组依据血栓形成持续时间分为3h组(5只)、6h组(5只)、9h组(5只)、12h组(5只)和24h组(5只)。2)采用小鼠下腔静脉内皮破坏法加缩窄法制作深静脉血栓模型，即用狗头夹住肾下极下腔静脉两处30秒，破坏下腔静脉内皮细胞；在结扎小鼠下腔静脉的时候，纵行放置一细线，可使下腔静脉缩窄约90％，造成其局部血流缓慢淤滞。3)血细胞分析仪检测外周血中PMN水平。HE法检测血栓周围静脉壁PMN、淋巴细胞及单核细胞水平。4)肾下极下腔静脉做HE切片染色，在光镜下(400倍)选择3个视野测PMN、淋巴细胞数量、单核细胞数量，并取平均值。5)肾下极下腔静脉做抗PMN、抗CD8+T细胞的免疫组化SP染色，在光镜下(400倍)选择3个视野，并取平均值。6)用SPSS13.0软件包统计分析，计量资料以mean±SD表示，组间采用t检验。 结果：1、手术组小鼠模型成功率100％，术后无死亡。2、待手术组取下腔静脉标本时，均可见静脉内血液较其它部位深，血液粘滞。3、通过细胞分类仪监测外周血炎性细胞在6个时段占有比例。中性粒细胞在0h比率约占25.4％，3h上升(P<0.05)，3h、6h、9h之间差异无显著性(P>0.05)，于12h(34.4％)达到术后低谷(P<0.05)，24h(59.6％)较12h明显升高(P<0.05)。4、HE染色提示：PMNs在3h明显比0h增加(P=0.008)，6h、9h缓慢增加，与3h无明显并异性(P>0.05)，12h较9h明显下降，又于24h达到最高值(P=0.001)。淋巴细胞在3h上升到最高(P<0.05)，后随着时间的推迟，逐渐下降。5、PMN染色提示：PMN在3h升高(P=0.002)，12h下降(P<0.05)，24h又再次的上升(P=0.001)。6、CD8+T在3h上升，但差异性不大(P=0.094)，可能与样本含量有关，24h又上升(P=0.025)。 结论：1、采用使小鼠下腔静脉血流减慢加静脉内皮破坏法制作静脉血栓模型建立DVT模型，2d能形成血栓，但小鼠在24h内不能形成块状血栓。2、DVT急性期PMN在24d后明显增高，可能与血栓形成密切相关。3、根据PMN的发展变化，在急性期的治疗有待进一步的研究。4、CD8+T细胞参加血栓前期形成，CD4+T亦有可能。

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中性粒细胞活化对深静脉血栓形成的动态影响 综述

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