局部碳酸酐酶抑制剂（派立明）对兔角膜内皮细胞影响的实验观察

摘要

目的：观察局部碳酸酐酶抑制剂(派立明)对兔角膜内皮细胞的影响，以评价派立明眼液是否影响角膜内皮。 方法：实验选择健康日本大耳白兔24只(泸州医学院实验动物中心提供)，体重均在2.5～3.0Kg，雌雄不限。实验动物置于同一条件的单独笼子中，整个实验过程食物、水源供给充分。实验前对每只实验用兔双眼行裂隙灯显微镜检查、非接触性角膜内皮显微镜测量角膜内皮细胞密度、Schiotz眼压计测量眼压、超声波角膜厚度测量仪测量角膜厚度。将上述各项指标均在正常范围内的动物随机分成2组，每组12只，药物作用时间点选择为每日8点、14点和20点。第一组的右眼滴用1％派立明，设为派立明组；左眼滴用0.9％生理盐水，设为派立明对照眼。第二组的右眼滴用相同剂量防腐剂0.05％苯扎氯胺(Benzalconium Chloride)，设为防腐剂组；左眼滴用0.9％生理盐水，设为防腐剂对照组。分别于用药后2周、4周和8周随机抽取实验用兔，每组各4只，分别行双眼裂隙灯显微镜检查，并测量角膜内皮细胞密度、眼压及角膜厚度。1％戊巴比妥钠溶液(3ml/Kg)耳缘静脉注射实施全身麻醉后，取双侧带有角膜缘外1mm巩膜的角膜。取每只角膜的1/2(同一部位)用台盼蓝和茜素红联合染色法染色：自行现配0.25％台盼蓝染液和0.2％茜素红染液，在角膜片内皮面上滴加0.25％台盼蓝染色液至完全覆盖角膜，90秒后BSS轻柔冲洗去除染色液，用滤纸吸去多余的BSS，再经0.2％茜素红染色90秒，BSS轻柔冲洗去除染色液。置于倒置像差显微镜下观察角膜内皮细胞形态的变化。根据活细胞不着色且细胞间质被红染，而死细胞其核被蓝染的特性，计数100个内皮细胞中核着色的细胞个数，即可得到内皮细胞的活性率(100-核着色的细胞数/100*100％)，采用显微镜计数法计数死亡细胞，每张切片在角膜中央区随机选取5个非重复视野计数，计算其活性内皮细胞的平均百分率。取部分剩余角膜(2×2mm2)，立即用4％戊二醛，锇酸溶液固定并标记，乙醇、丙酮脱水，包埋后超薄切片，行透射电镜检查并照相。剩余的角膜组织于10％福尔马林中固定并标记，行病理组织学检查并照相。统计学分析：采用SPSS12.0统计软件，各组数据进行正态性检验，采用配对t检验，方差分析对数据进行分析处理，P<0.05有统计学意义。 结果： (1)裂隙灯检查：实验后第2周、4周和8周派立明组角膜透明、未见明显变化。滴用派立明眼液各组球结膜可出现—过性充血，无水肿及分泌物增多，无角膜混浊及角膜溃疡，无前房炎症反应，未见晶状体混浊。实验过程中派立明组与防腐剂组各有1只兔眼结膜弥漫性充血，以下方睑球结膜明显，未见滤泡增生，结膜囊见少量粘液状分泌物，角膜透明、上皮完整，未见点状缺损。至用药后4-8周该现象仍持续存在，但不加重。 (2)眼压测量结果：实验前派立明组眼压为12.74±3.12mmHg：实验8周后眼压为11.23±2.13mmHg，差异有统计学意义。派立明对照组眼压12.68±2.61mmHg，8周后眼压为12.13±4.10 mmHg，经统计学分析差异无显著性(P>0.05)。派立明对照组眼压稍有降低，但下降值明显低于派立明组，两组的差异有显著性(P<0.05)。 (3)角膜厚度测量：实验前派立明组和派立明对照组兔角膜厚度分别为59.17±21.35um，359.17±20.65um，于用药后2周派立明组和派立明对照组兔角膜厚度分别为369.5±18.48um，370.75±29.70um；4周时两组兔角膜厚度分别为377.25±31.19um，370.88±28.40um；8周时两组角膜厚度分别是390.75±15.65um，418.50±14.27um，每个时间段派立明组与派立明对照组的角膜厚度相比较，经统计学分析差别均无统计学意义(P>0.05)。实验前防腐剂组角膜厚度361.08±32.25um，用药后2周、4周及8周后角膜厚度分别是370.75±29.70 um，370.88±28.40 um，418.50±14.27 um。每组数值与相应时间的派立明组的数值相比较，统计学比较无显著性差异(P>0.05)。各时间点各组角膜厚度与实验前的相应数值比较均无明显差异(P>0.05)。 (4)角膜内皮细胞密度观察结果：派立明组与防腐剂组角膜内皮细胞密度实验前分别为3229.17±457.99个/mm2，3062.50±555.19个/mm2，2周时两组分别为2833.33±288.68个/mm2，2800.00±354.19个/mm2；第4周时两组的内皮细胞密度分别为2906.25±325.62个/mm2，2781.25±339.05个/mm2；至8周时派立明组与防腐剂组数值分别为2812.50±473.24个/mm2，2375.00±250.00个/mm2，以上各时间点两组内皮细胞密度均无明显差异，与实验前的相应数值比较均无明显差异(P>0.05)。 (5)角膜内皮细胞台盼蓝和茜素红联合染色法观察细胞活性并计算细胞活性率：实验后第2周、4周及8周角膜内皮细胞形态无明显变化，见少数细胞质红染，细胞核蓝染，未见细胞脱落。实验后2周时派立明组角膜内皮细胞活性率为99.51±0.04％，防腐剂组为99.29±0.20％；实验后4周时派立明组和防腐剂组的内皮细胞活性率分别为99.45±0.08％,99.10±0.15％：实验后8周时派立明组和防腐剂组相应数值分别为99.36±0.06％，99.33±0.13％，经t检验分析，以上时间点派立明组与防腐剂组内皮活性率差别亦无统计学意义(P>0.05)。派立明对照组每个时间点的数值分别为：99.54±0.03％、99.37±0.15％和99.40±0.13％，与相应时间点的派立明组的数值相比较，差别无统计学意义(P>0.05)。 (6)光学显微镜观察：派立明组于用药后第2周、4周及8周角膜组织内皮细胞无明显变化，内皮细胞排列整齐，连接紧密，未见内皮细胞多层样变化。同一时间点派立明组与防腐剂组角膜相比，各组角膜基质层均未见增厚，胶原纤维排列紧密，其间无水肿液。 (7)透射电镜观察：派立明组和防腐剂组角膜内皮细胞均未发生显著病理性改变，细胞呈六边形镶嵌型排列，细胞膜透明、完整，核膜完整，细胞质内未见线粒体肿胀，未见空泡样变，厚度无明显增加。 结论：使用局部碳酸酐酶抑制剂与防腐剂做对照比较，对兔角膜内皮细胞均未造成明显损害，影响无差别。随实验观察2周、4周和8周，分别通过对兔角膜进行裂隙灯显微镜检查、角膜厚度测量、内皮细胞密度测量和内皮细胞形态学的检查，均未见内皮细胞的损坏。说明局部碳酸酐酶抑制剂派立明短期内未对兔角膜内皮细胞产生影响，远期的影响有待于进一步观察。

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碳酸酐酶与眼功能 综述