TaqMan探针实时荧光定量PCR检测慢性心房颤动患者心房肌中SK2通道mRNA的表达

摘要

目的:心房颤动(Atrial Fibrillation，AF)简称房颤，是临床常见的快速心律失常，其发病机制尚未完全清楚。随着膜片钳和分子生物学等技术在心血管疾病研究领域的广泛应用，人们在细胞和分子水平探索房颤发生和维持的机制，并为房颤的防治提供实验依据已成为可能。近年，人类心房肌中出人意料的发现存在钙激活钾电流(IKca)，并确定该电流由SK2通道(Small conductance calcium-activated potassium channel 2，SK2)介导。使用SK2通道特异性阻断剂蜂毒明肽(apamin)后，细胞动作电位复极期时程明显延长，提示SK2通道在动作电位的复极期发挥作用。目前，有关房颤患者心房肌组织中SK2基因表达水平的检测未见报道。本实验采用TaqMan探针实时荧光定量PCR技术检测13例风湿性心脏病窦性心律患者和15例风湿性心脏病慢性房颤患者心房肌组织中SK2通道α亚单位mRNA的表达水平，为探讨SK2通道在房颤中的作用提供实验依据。方法:标本来自泸州医学院附属医院体外循环手术患者常规切除的右心耳组织，患者经心脏彩超和心电图证实为风心病窦性心律或风心病慢性房颤。将标本分为窦律组(SR组)和房颤组(AF组)，两组间患者年龄无统计学差异。实验操作步骤为:(1)心耳组织被迅速转移至液氮中，备用。(2)提取心房肌组织总RNA。(3)总RNA逆转录合成eDNA。(4)利用PCR技术将小部分eDNA扩增，得到目的基因SK2和内参基因β-actin的DNA片段。(5)将纯化后DNA片段与pMD18-TVector在16℃连接12h。产物转化入感受态大肠杆菌中，涂布于固体LB培养板上，37℃孵育8h。(6)挑取平板上白色菌落，摇菌12h。提取质粒，制做成标准品。(7)质粒进行TaqMan探针实时荧光定量PCR反应，定量软件绘制标准曲线和方程式。(8)将(3)所得AF和SR两组eDNA，进行TaqMan探针实时荧光定量PCR。依据标准曲线方程式，计算出样品初始模板量。(9)数据以均数±标准差(-x±S)表示，使用t检验检测组间均数差异，P<0.05有统计学意义。所有数据统计在SPSS 13.0 for windows版软件包上完成。结果:(1)利用紫外线线分光计对提取的总RNA进行光吸收度测量，A260/280在1.90～2.10之间，A260/230在1.80～2.10之间，浓度大于300ng/μl，表明RNA的纯度及浓度在理想范围内；总RNA电泳结果显示:28S条带和18S条带清晰，无托尾；灰度比大于1，5S带不明显，表明RNA完整性较好。(2)SK2和β-actin的标准曲线线性关系良好，相关系数(R2)均大于0.99。SK2的标准曲线方程为Y=0.219X+6.44，R2=0.997；β-actin的标准曲线方程为:Y=0.242X+7.12，R2=0.997。(3)SR组和AF组SK2/β-actin比值分别为0.0782±0.0442(n=13)和0.0423±0.093(n=15)，t=2.753(P<0.05)，差异有统计学意义。结论:(1)人体心房肌组织中存在SK2基因表达。(2)慢性房颤患者心房肌组织中SK2基因表达水平低于窦性心律患者，提示SK2mRNA表达的下调可能参与房颤发生的病理过程。

目录

论文说明:英汉缩略词对照表

声明

摘要

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

致谢

蛋白质组学在心血管疾病中的研究进展 综述