接受GM-CSF+Anti-Siglec-9刺激的中性粒细胞程序化细胞死亡和线粒体及相关基因表达的研究

摘要

目的：中性粒细胞（polymorphonuclear neutrophils，PMN）在机体固有性免疫应答中具有重要作用，它是一把双刃剑，其胞浆内富含的细胞毒性物质既可杀伤外来入侵的病原微生物，也可造成自身组织细胞的损伤。中性粒细胞通过程序化细胞死亡被吞噬细胞吞噬清除，从而避免炎症反应扩大化，减少自身组织细胞损伤。Stephan等在研究GM-CSF+Anti-Siglec-9刺激人中性粒细胞时，发现Siglec-9介导了caspase-3、caspase-8依赖性和caspase-3、caspase-8非依赖性的PMN死亡，两者都有活性氧簇（ROS）的参与，并且caspase-3、caspase-8非依赖性的PMN死亡具有非凋亡程序化细胞死亡的形态学特征[1]。本课题对GM-CSF+Anti-Siglec-9（抗表面分子唾液酸性粘合免疫球蛋白样凝集素-9（anti-surface molecule sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin-9，Anti-Siglec-9）刺激人中性粒细胞程序化细胞死亡进行了形态学观察，并进一步研究其分子机制，探讨NDP（NADH-ubiquinone oxidoreductase Fe-S protein，complexⅠ）、 SDH（succinate dehydrogenase flavoprotein subunit，complexⅡ）、Cyt P450（Cytochrome P450，complexⅢ）、COXs（cytochrome c oxidase subunit，complexⅣ）、Smac（线粒体蛋白）、 AIF（Apoptosis induced factor）、 Apaf-1（apoptosis protease-activating factor-1）、caspase-9、IAP（inhibitor of apoptosis protein）和线粒体在这种死亡形式中发挥的作用，为揭示这种中性粒细胞死亡过程中信号转导的途径并发展有效的免疫学措施以调控炎症奠定实验和理论基础。 方法：分离、纯化正常人外周血中性粒细胞，在分别加入GM-CSF、Antimycin A（抗霉素A）、Anti-Siglec-9、GM-CSF+Anti-Siglec-9和不加任何刺激物情况下进行培养，构建致炎细胞因子（proinflammatory cytokine）、呼吸链阻断、表面分子唾液酸性粘合免疫球蛋白样凝集素-9结扎（Siglec-9ligation）、程序化细胞死亡和自发性凋亡的细胞模型。运用光镜和激光共聚焦显微镜对不同培养条件下产生的细胞模型进行形态学研究；低分子量琼脂糖电泳显示DNA片断化；提取程序化细胞死亡组和自发性凋亡组中性粒细胞蛋白，SDS-PAGE观察各组蛋白表达情况；用抗AIF单克隆抗体通过western blotting技术检测并比较AIF在不同死亡模型中的表达状态；RT-PCR技术检测NDP、SDH、Cyt P450、COXs、Smac、AIF、Apaf-1、caspase-9、IAP的mRNA表达水平。 结果：1.激光共聚焦扫描显微镜的结果显示，GM-CSF+Anti-Siglec-9刺激组的中性粒细胞线粒体形态与功能发生了变化，且与自发性凋亡组在细胞核染色和线粒体的结构上都有十分明显的差异。2.GM-CSF+Anti-Siglec-9刺激中性粒细胞9小时后，激光共聚焦扫描显微镜显示：细胞形态发生显著改变，绝大多数中性粒细胞的多叶核融合成单叶核，胞浆内诸多空泡样结构，但细胞膜保持完整性及无凋亡小体，不同于坏死和自发性凋亡。3.低分子量DNA琼脂糖电泳显示，自发性凋亡组生成200 bp整数倍的DNA梯形条带（DNA ladder），GM-CSF+Anti-Siglec-9刺激的程序化细胞死亡组出现短而弥散的DNA电泳谱带，主要分布在分子量较大的区段。4.不同时间段提取中性粒细胞蛋白，用抗AIF单克隆抗体对不同死亡模型进行western blotting分析。 结果显示：随着培养时间延长，GM-CSF+Anti-Siglec-9可以刺激中性粒细胞AIF具有促中性粒细胞死亡的作用，其表达上调将引起中性粒细胞死亡加速。5. RT-PCR分析NDP、SDH、Cyt P450、COXs、Smac、AIF、Apaf-1、caspase-9和IAP的mRNA表达水平。实验结果显示：GM-CSF组IAP基因的表达上调和SDH基因的表达下调（P<0.01），Antimycin A组NDP、SDH、Smac和caspase-9四个基因的表达均上调（P<0.01）。Anti-Siglec-9组Smac和caspase-9两个基因的表达均上调（P<0.01），GM-CSF+Anti-Siglec-9组与自发性凋亡组比较Cyt P450、COXs、Smac、AIF、caspase-9五个基因表达均明显上调（P<0.01）。6.激光共聚焦显示的AIF表达情况，发现与自发性凋亡组比较，GM-CSF+Anti-Siglec-9刺激组的中性粒细胞上调AIF的表达水平（P<0.01）。 结论：1.GM-CSF+Anti-Siglec-9可以诱导人中性粒细胞产生程序化细胞死亡，而且其死亡信号的传导不同于传统的凋亡。2.线粒体膜通透性增加导致跨膜电位降低可能是GM-CSF+Anti-Siglec-9诱导中性粒细胞不同于传统凋亡的程序化细胞死亡的重要分子基础。3.Cyt P450、 COXs、 Smac、 AIF、 caspase-9参与GM-CSF+Anti-Siglec-9诱导人中性粒细胞不同于传统凋亡的程序化细胞死亡的线粒体信号传导途径。4.NDP、SDH、Smac和caspase-9参与AntimycinA诱导人中性粒细胞线粒体呼吸链阻断的死亡的信号传导途径。5.AIF表达上调可能是GM-CSF+Anti-Siglec-9诱导的人中性粒细胞不同于传统凋亡的程序化细胞死亡只出现短而弥散的DNA大片段化的主要原因之一。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英汉缩略名词对照表

声明

前言

材料与方法

实验流程图(Experimental protocol)

结果

1 新鲜分离中性粒细胞活性纯度鉴定

2激光共聚焦扫描显微镜观察中性粒细胞线粒体变化

3 激光共聚焦扫描显微镜观察中性粒细胞细胞核及引发DNA大片段化的AIF的表达

4低分子量琼脂糖电泳结果

5 RT-PCR检测NDP、SDH、Cyt P450、COXs、Smac、AIF、Apaf-1、caspase-9和IAP基因表达

6 DNA测序结果

7免疫印迹检测AIF的表达

8 AIF表达与GM-CSF+Anti—Siglec-9诱导的人中性粒细胞不同于传统凋亡的程序化细胞死亡只出现短而弥散的DNA大片段化的关系

讨论

结论

参考文献

致谢

综述： 中性粒细胞非凋亡程序化细胞死亡分子机制的研究概况