目的:运用蛋白质组学方法,寻找慢性乙肝中医肝肾阴虚证、脾肾阳虚证患者外周血浆中差异表达的蛋白质,分析其与慢性乙肝中医虚证证侯的对应关系,初步探索出慢性乙肝中医虚证的蛋白质组学规律,为中医临床辨识慢性乙肝虚证提供可供参考的客观化指标,最终为进一步探讨慢性乙肝中医虚证的分子基础提供线索。方法:通过双向凝胶电泳,获得正常对照组、肝肾阴虚证组、脾肾阳虚证组的血浆蛋白质(Two-dimensionalelectrophoresis,2-DE)图谱,经质谱分析鉴定出差异表达的蛋白质。具体方法:依据《病毒性肝炎中医辨证标准》,在泸州医学院附属中医医院2008年5月～2009年8月期间的住院和门诊慢性乙肝患者中,收集典型的肝肾阴虚证、脾肾阳虚证及健康正常人各三例作为研究对象,对其血浆蛋白进行双向凝胶电泳。第一向采用PH4-7的固相PH梯度胶条(immobilized pHgradients,IPG)等电聚焦(isoelectrofocusing,IEF),第二向采用浓度为12％的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium-dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)。硝酸银染色后并经凝胶图像采集系统获得血浆蛋白质2-DE图谱,采用ImageMaster2D Platinum V5.0软件对组内及组间的图谱对比分析,依据IPG胶条的固相PH梯度中等电点pI线性梯度和标准分子量Marker,确定各蛋白点的相对分子量(Da)、相对等电点(pI),将实验组与对照组的双向电泳结果出现标准化总灰度值(％Vol)相差达2倍以上的蛋白点视为差异表达蛋白质,切取相应的差异表达蛋白点作质谱分析,搜索SWISS-PROT数据库,鉴定出各差异表达的蛋白质,初步建立起差异表达的蛋白质与慢性乙肝虚证的对应关系。结果:(1)各组血浆蛋白2-DE图谱中大多数蛋白点分布在p14.5-6.5,分子量25—90kD的范围内。经ImageMaster2D Platinum v5.0软件分析,各组均可获得重复性稳定的蛋白点约450±100个。(2)慢性乙肝中肝肾阴虚证组的2-DE图谱与正常组对比表现为蛋白点4、7表达量明显升高,蛋白点3、8、9表达量明显下降。经质谱分析鉴定并结合Swiss-prot蛋白数据库得出:蛋白点4为C-反应蛋白(C-reactive protein CRP)、蛋白点7为甲状腺素结合蛋白(Thyroxine—binding protein TTR)、蛋白点3为载脂蛋白A2(Apo-A2)、蛋白点8、9为同一蛋白--结合珠蛋白(Haptoglobin HP)。(3)慢性乙肝中脾肾阳虚证组的2-DE图谱与正常组对比表现为蛋白点1、2、3、7、8、9表达量明显下降,蛋白点5、6表达量明显升高。经质谱分析鉴定并结合Swiss-prot蛋白数据库得出:蛋白点1为载脂蛋白C2(Apo-C2)、蛋白点2为血清淀粉蛋白P(Serum amyloid SAP)、蛋白点3为(APO-A2)、蛋白点7为甲状腺素结合蛋白(TTR)、蛋白点8、9为同一蛋白--结合珠蛋白(HP)、蛋白点5、6为同一蛋白--血浆视黄醇结合蛋白(Plasmaretinol—binding protein RBP)。(4)归纳总结慢性乙肝中医二虚证与正常对照组2-DE图谱发现,慢性乙肝中医二虚证与正常人相比存在明显的规律性差异,表现为蛋白点3、8、9(分别为APO-A2、HP)表达量均明显下降。结论:(1)成功建立起慢性乙肝肝肾阴虚证组、脾肾阳虚证及正常对照组血浆蛋白质组2-DE图谱。(2)慢性乙肝中肝肾阴虚证组除了APO-A2、HP明显下降外,还表现CRP、TTR表达量明显升高,而在正常人和脾肾阳虚证组中均未体现,推测CRP、TTR.表达量的升高参与了慢性乙肝中肝肾阴虚证侯的形成机制。进一步深入研究,可望为临床该证型的诊断提供客观化分子指标。(3)慢性乙肝中脾肾阳虚证组除了APO-A2、HP表达量明显下降外,还表现为Apo-C2、SAP、TTR.表达量明显下降,RBP表达量明显升高,推测这些蛋白质表达量的变化可能与慢性乙肝中脾肾阳虚证的病理机制相关。临床通过对慢性乙肝患者血浆蛋白质组的筛查,可能为临床该证型的诊断找到客观化分子诊断指标。(4)归纳总结慢性乙肝中医二虚证与正常对照组之间2-DE图谱相比存在明显的规律性差异,表现为APO-A2、HP表达量均明显下降,提示慢性乙肝中医二虚证具有相同的蛋白质变化规律,推测这些相同的蛋白质变化可能与慢性乙肝各中医虚型证型的形成机制有关。通过进一步深入研究,可望为临床慢性乙肝虚证的诊断提供客观的分子指标。
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