CTGF-整合素ανβ5受体信号途径在PASMC增殖、迁移、细胞骨架改变和细胞外基质基因表达中的作用

摘要

目的:1、探讨整合素αvβ5在CTGF促进PASMC增殖、迁移、细胞骨架变化和细胞外基质沉积中的作用。2、明确细胞外调节蛋白激酶(ERK1／2)信号通路是否参与了CTGF-整合素αvβ5信号途径所致PASMC上述生物学行为改变的过程。3、初步探讨CTGF－整合素αvβ5受体信号途径在肺动脉高压肺血管重构中的作用。
　　 方法:1.体外培养SD大鼠PASMC,并用a－SMA免疫组化染色鉴定细胞纯度。将实验分为空白组、CTGF(50ng／ml)组、CTGF(50ng／ml)+整合素αvβ5单克隆抗体P1F6组。2、WST-1检测不同时间点及不同浓度P1F6对CTGF促进PASMC增殖的影响,找出最佳干预时间点及最佳干预浓度。3、采用Transwell小室检测P1F6对CTGF促进PASMC迁移的影响。4、采用考马斯亮蓝R250染色观察CTGF、CTGF+P1F6对细胞骨架改变的影响；并用激光共聚焦显微镜技术检测FAK表达的变化。5、实时荧光定量RT-PCR检测CTGF、P1F6对CollagenⅠ-α1、CollagenⅢ-α1、Fibronectin-1 mRNA表达的影响。6、采用Western—blot检测P1F6、CTGF对CollagenⅢ、ERK1／2、p-ERK1／2蛋白表达的变化。
　　 结果:1、免疫组化染色显示,a-SMA染色阳性细胞大于95％,表明其为PASMC。2、用CTGF(50ng／ml)和0、5、10、15μg／ml整合素αvβ5抗体P1F6分别刺激PASMC0h、24h、48h、72h和96h,WST-1检测结果表明,整合素αvβ5抗体对CTGF促进PASMC增殖有明显抑制作用。其中P1F6为10μg／ml72h时抑制率为25.6％,差异有统计学意义(P<0.01)；P1F6为15μg／ml72h时抑制率为35％,差异有统计学意义(P<0.01)。由此求出整合素αvβ5抗体最佳干预浓度为15μg／ml,最佳刺激时间为72h。3、Transwell小室检测结果显示,P1F6(10μg／ml)作用PASMC24h后,CTGF促进PASMC迁移受到明显抑制(P<0.001)。4、考马斯亮蓝R250染色观察细胞骨架变化结果发现24h时,各组之间细胞骨架变化不明显；在12h时与对照组比较,CTGF组能短暂改变细胞形态,使细胞骨架模糊不清；加入P1F6后,CTGF所引起的细胞形态变化不明显。用激光共聚焦显微镜观察P1F6、CTGF作用下PASMC中FAK表达变化,结果显示CTGF组于对照组相比,12h及24h细胞胞质皱缩,细胞形态变小,FAK形成均显著减少,其中以24h变化最明显。加入P1F6封闭整合素αvβ5后,与CTGF组比较上述变化不明显,但FAK形成较对照组仍有减少,其中以24h最明显。5、RT-PCR检测结果显示,与对照组比较,CTGF作用于PASMC72h,CTGF能显著促进CollagenⅠ-α、CollagenⅢ-α1、Fibronectin-1 mRNA表达(P<0.05)；使用P1F6后与CTGF组比较三种基因mRNA表达均减少(P<0.05),但均较对照组表达增加。6、蛋白质印迹检测结果表明,CTGF作用于PASMC72h,与对照组比较CTGF明显促进CollagenⅢ蛋白表达(P<0.05)；应用P1F6后CollagenⅢ蛋白表达较CTGF组减少(P<0.05),但较对照组表达增加。用Western-blot检测P1F6、CTGF作用PASMC72h后ERK1／2磷酸化水平,结果提示CTGF作用PASMC72h后ERK1／2磷酸化程度增加,加入P1F6封闭整合素αvβ5后ERK1／2磷酸化程度降低,pERK1／2与ERK1／2比值减小(P<0.05)。
　　 结论:1.整合素αvβ5介导了CTGF诱导的PASMC增殖、迁移和细胞骨架变化及细胞外基质基因的表达。2.ERK1／2信号通路参与CTGF-整合素αvβ5受体信号诱导的PASMC生物学行为改变,其可能在PAH肺血管重构中起重要作用,此途径可能是防止和干预PAH肺血管重构发生和发展的新靶点。

目录

文摘

英文文摘

前言

1.材料和方法

1.1.主要实验仪器

1.2.主要实验试剂

1.3.大鼠肺动脉平滑肌细胞原代培养

1.4.PASMC传代培养

1.5.PASMC纯化

1.6.培养细胞鉴定

1.7.整合素αvβ5在CTGF促进PASMC增殖中的作用

1.8.整合素αvβ5在CTGF促进PASMC迁移中的作用

1.9.整合素αvβ5在CTGF促进PASMC细胞骨架变化中的作用

1.10.整合素αvβ5在CTGF促进PASMC胶原和纤维连接蛋白基因表达中的作用

1.11.Western Blot检测整合素αvβ5在CTGF促进PASMCⅢ型胶原蛋白表达ERK1/2磷酸化水平中的作用

2.实验结果

2.1 培养细胞的鉴定

2.2 整合素αvβ5在CTGF促进PASMC增殖中的作用

2.3 整合素αvβ5在CTGF促进PASMC迁移中的作用

2.4 整合素αvβ5在CTGF促进PASMC细胞骨架变化中的作用

2.5 整合素αvβ5在CTGF促进PASMC Collagen Ⅰ-α 1,CollagenⅢ-α1和Fibronectin-1 mRNA表达中的作用

2.5.1 应用荧光定量RT-PCR检测各目的基因mRNA表达

2.5.2 Western-blot检测CollagenⅢ、pERK/1/2及ERK/1/2蛋白表达

3.讨论

3.1 整合素αvβ5在CTGF促进PASMC增殖和迁移中的作用

3.2 整合素αvβ5在CTGF促进PASMC细胞骨架变化中的作用

3.3 整合素αvβ5在CTGF促进PASMC细胞外基质蛋白表达中的作用

4.结论

参考文献

英汉缩略词对照表

综述 整合素在血管平滑肌细胞增殖和迁移中作用的研究进展

参考文献

致谢

攻读硕士学位撰写及发表的学术论文