支气管哮喘外周血淋巴细胞DNA损伤与氧化应激的相关性研究

摘要

目的:检测支气管哮喘患者外周血淋巴细胞DNA损伤和血浆MPO、MDA含量,探讨DNA损伤与氧化应激的相关性,从而为哮喘的防治提供新的思路。
　　 方法:1.以支气管哮喘患者为研究对象,20例重症哮喘患者作为重度组,9例轻度哮喘患者作为轻度组、9例健康体检者作为正常组。肘静脉采血检测淋巴细胞DNA损伤及血浆MPO、MDA含量。2.彗星实验检测淋巴细胞DNA损伤:枸橼酸化的静脉血2ml与HanK’s液2ml混匀,小心加于2ml淋巴细胞分离液的表面上,1500转／分离心15分钟,收集分界处淋巴细胞,再次1500转／分离心10分钟,收集新鲜的淋巴细胞沉淀20μl与0.7％低熔点凝胶75μl混匀后,铺于预先铺有加热的1％正常熔点凝胶的载玻片上,加盖玻片,4℃冷藏放置10分钟使胶牢固。移去盖玻片,将载玻片放入装有预冷的细胞裂解混悬液中,4℃下裂解至少1小时。取出载玻片用生理盐水漂洗两次,置入碱性电泳缓冲液中,室温放置20分钟使DNA碱解旋,然后电泳(25 V／300 mA,20 min)。电泳后取出载玻片,生理盐水漂洗两次。溴化乙锭避光染色(70μl／玻片)10分钟。应用荧光显微镜(激发光波长515-560nm),200倍视野观察核DNA和迁移DNA,每个样本选取50个细胞拍照,图片保存后应用TriTek CometScoreTM软件对图片进行分析,以尾长(TL)和尾距(TM)为指标,观察DNA损伤程度。3.血浆MPO含量的测定:应用ELISA测定血浆中MPO的水平。向预先包被了MPO单克隆抗体的酶标孔中加入MPO,温育；洗涤后,加入HRP标记过的MPO抗体。再经过温育和洗涤,去除未结合的酶,然后加入底物A、B,产生蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅与样品中MPO的浓度呈正相关。在450nm波长下测定OD值,根据标准品和样品的OD值,计算样本中MPO含量。4.血浆MDA含量的测定:过氧化脂质降解产物中的MDA可与硫代巴比妥酸缩合,生成红色产物,在532nm波长处有最大吸收峰,应用比色法测定吸光度值,用计算公式计算血浆MDA含量。
　　 结果:1.淋巴细胞DNA损伤观察。①尾长(TL)比较:重度组与轻度组和正常组TL比较,重度组明显高于轻度组和正常组,有统计学意义(p<0.05)；轻度组与正常组比较,轻度组高于正常组,具有统计学意义(p<0.05)。②尾距(TM)比较:重度组与轻度组和正常组TM比较,重度组明显高于轻度组和正常组,有统计学意义(p<0.05)；轻度组与正常组比较,无明显差异无统计学意义(p>0.05)。2.血浆MPO含量变化:重度组血浆MPO含量明显高于轻度组和正常组,有统计学意义(p<0.05)；轻度组和正常组比较,高于正常组,有统计学意义(p<0.05)。3.血浆MDA含量变化:重度组血浆MDA含量明显高于轻度组和正常组,有统计学意义(p<0.05)；轻度组和正常组比较,轻度组高于正常组,有统计学意义(p<0.05)。4.相关性分析显示:重度组TL与TM之间呈正相关(p<0.01)；重度组TL与MPO含量之间呈正相关(p<0.01),重度组TM与MPO含量之间呈正相关(p<0.01)；重度组TL与MDA含量之间呈正相关(p<0.01)；重度组TM与MDA含量之间呈正相关(p<0.01),重度组MPO含量与MDA含量之间呈正相关(p<0.01)。各组详细统计数据见图表。
　　 结论:1.支气管哮喘急性发作时存在明显淋巴细胞DNA损伤,病情越重,损伤越明显。2.哮喘急性发作期氧化应激指标血浆MPO和MDA明显升高,重症哮喘尤为明显。3.哮喘患者外周血氧化应激指标MPO、MDA含量与淋巴细胞DNA损伤程度呈明显正相关。4.氧化应激参与了支气管哮喘淋巴细胞DNA损伤。

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髓过氧化物酶与重症哮喘(综述)

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