直接肾素抑制剂与钙通道阻滞剂对肾动脉狭窄性大鼠大动脉斑块稳定性的比较研究

摘要

背景及目的:动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是一种系统性、进展性动脉内膜疾病,AS斑块的形成及破裂是肾动脉狭窄(Renal arterystenosis,RAS)主要的病理基础。目前,对RAS治疗的最佳措施尚存争议,临床上采用血管支架成形术虽在短期内可显著改善患者血压,但长期能否具有保护肾脏这一靶器官的作用尚不清楚。近年研究发现,一些抗高血压药物如钙通道阻滞剂等在降低血压的同时,亦具有抗AS的作用。直接肾素抑制剂作为一种新型抗高血压药物,从源头阻断肾素的产生,它亦具有降压和抗AS的双重作用。然而,直接肾素抑制剂与钙通道阻滞剂在治疗RAS上的比较研究尚缺乏足够的证据,加之单、双侧肾动脉狭窄所致高血压的机制不同,造成临床上选择合适的降压药治疗RAS显得比较困难。为此,我们采用不同手术方式复制单、双侧肾动脉狭窄并联合高脂饲养及注射VitD3建立起动脉粥样硬化合并肾动脉狭窄动物模型,通过测定血脂、肾功能及血浆肾素活性(PRA)的变化,并观察和测定主动脉斑块部位巨噬细胞特异性标记抗原CD68、血管平滑肌细胞表型标志物α-SMA及基质金属蛋白酶(MMP)1,2,9的分布及量的变化,探索直接肾素抑制剂及钙通道阻滞剂对斑块稳定性的影响及可能的机制,拟为临床合理、有效治疗动脉粥样硬化性肾动脉狭窄提供理论依据和策略。
　　 方法:1、动物模型的建立:将78只雄性SD大鼠随机分为一肾一夹(OneKidney One Clip,1K1C)组、二肾一夹(Two Kidney One Clip,2K1C)组及对照组,1K1C组及2K1C组采用平行针灸针缩窄法造成肾动脉狭窄,对照组则只暴露肾动脉,不做狭窄造模。各组大鼠均予注射VitD350万IU／kg并高脂饲养(10％猪油+5％白糖+2％胆固醇+0.5％胆酸钠)10周建立AS合并肾动脉狭窄动物模型。2、直接肾素抑制剂与钙通道阻滞剂对肾动脉狭窄性大鼠大动脉斑块稳定性的研究:饲养10周后,将对照组及满足实验要求的1K1C组、2K1C组大鼠分别随机分组并给予干预措施:生理盐水组(0.9％NS2ml／d)、阿利吉仑组(50mg／kg.d)及苯磺酸氨氯地平组(6mg／kg.d),干预时间为4周。干预4周后处理大鼠,分以下几部份进行试验:(1)、心脏采血后全自动生化分析仪检测血甘油三酯、胆固醇、尿素氮及血肌酐,放射免疫法检测血浆肾素活性(Plasma renin activity,PRA)；(2)、游离并切取SD大鼠主动脉及狭窄侧肾脏,一部分石蜡包埋做HE染色(血管组织)和PAS染色(肾脏)；一部分-70℃冷冻保存；(3)免疫组织化学法检测巨噬细胞CD68、α-SMA及MMP1,2,9的表达:取主动脉石蜡切片,采用SABC法,分别检测巨噬细胞CD68、α-SMA及MMP1,2,9在斑块上的表达变化,以PBS代替一抗作阴性对照,斑块区域出现棕黄色颗粒染色为阳性。图像采集后用Image-pro plus6.0软件分析,比较各组的平均光密度值(Mean optical density,MOD)；(4)Western—blot检测MMP9的表达:取冷冻保存的各组主动脉组织经提取蛋白、变性、电泳、转膜及一、二抗孵育后滴加发光液,凝胶成像仪照相后用Quangtity one软件分析目的条带和内参条带灰度值,比较MMP9在各组大鼠大动脉斑块中的表达变化。
　　 结果:1.采用平行针灸针缩窄法联合高脂饮食(10％猪油+5％白糖+2％胆固醇+0.5％胆酸钠)并注射VitD350万IU／kg10周可有效建立动脉粥样硬化合并。肾动脉狭窄动物模型。
　　 2.生化仪检测血脂及肾功能结果:与造模前相比,术后各组大鼠血胆固醇(TC)水平均显著升高(P<0.05)；与术后生理盐水组相比较,术后阿利吉仑组血TC升高水平差异显著(P<0.05),而术后氨氯地平组TC升高水平则差异无显著性(P>0.05)；术后阿利吉仑组与术后氨氯地平组TC升高水平比较亦有显著性(P<0.05)。比较造模前、后血肌酐(Scr)升高水平的变化,生理盐水组及氨氯地平组均有统计学意义(P<0.05),而阿利吉仑组术前、后比较差异不显著(P>0.05)；与术后生理盐水组比较,术后阿利吉仑组Scr升高水平差异有显著性(P<0.05)；而术后阿利吉仑组与术后氨氯地平组间比较差异无显著性(P>0.05)。
　　 3.放射免疫法检测PRA结果:与生理盐水组比较,相同造模方式阿利吉仑组PRA均显著下降(P<0.05),而2K1C及1K1C氨氯地平组则显著升高(P<0.05)；阿利吉仑组与氨氯地平组组间比较差异亦有统计学意义(P<0.05)。
　　 4.免疫组化结果:比较相同手术造模方式的实验大鼠斑块部位α-SMA、巨噬细胞CD68及MMPs表达的平均光密度值(MOD)
　　 ①斑块部位α-SMA的表达:阿利吉仑组和氨氯地平组与生理盐水组间以及阿利吉仑组与氨氯地平组间差异均有显著性(P<0.05)。
　　 ②斑块部位巨噬细胞CD68的表达:2K1C氨氯地平组与生理盐水组间比较差异无显著性(P>0.05),余各组间比较差异均有显著性(P<0.05)。
　　 ③斑块部位MMPs的表达:与生理盐水组相比,对照氨氯地平组及1K1C氨氯地平组MMP1,2的表达差异均无统计学意义(P>0.05)；同样,1K1C及2K1C氨氯地平组MMP9的表达差异亦无显著性(P>0.05)。余各组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。
　　 5.Western—blot检测相同造模方式各实验大鼠MMP9的表达:以目标条带灰度值／内参条带灰度值表示,与生理盐水组比较,阿利吉仑组MMP9表达均显著下降(P<0.05),而1K1C及2K1C氨氯地平组却并无统计学意义(P>0.05),与免疫组化结果一致。
　　 结论:1.采用平行针灸针缩窄法联合高脂饲养并注射VitD3可有效建立动脉粥样硬化合并肾动脉狭窄动物模型。2.直接肾素抑制剂阿利吉仑与钙通道阻滞剂苯磺酸氨氯地平有相似的降压作用,但阿利吉仑可显著降低肾动脉狭窄性大鼠PRA,且可能对血浆胆固醇水平的抑制更加有益。3.钙通道阻滞剂苯磺酸氨氯地平可增加斑块部位α-SMA的表达,并抑制2K1C大鼠斑块部位MMP1、MMP2及1K1C斑块部位巨噬细胞CD68和对照组MMP9的表达,对2K1C大鼠斑块部位CD68及2K1C和1K1C大鼠斑块部位MMP9的表达无明显抑制作用,而直接肾素抑制剂-阿利吉仑亦可增加斑块部位α-SMA的表达,并抑制斑块部位巨噬细胞CD68、MMP1、MMP2、MMP9的表达,提示阿利吉仑稳定AS斑块的作用可能优于苯磺酸氨氯地平。

目录

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结果

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结论

参考文献

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致谢

动脉粥样硬化斑块不稳定性机制的研究进展(综述)

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