斯氏狸殖吸虫线粒体cytb基因的扩增、测序,和cytb基因在斯氏狸殖吸虫不同虫期的表达

摘要

目的:扩增出斯氏狸殖吸虫线粒体 cytb基因片段并测序,研究斯氏狸殖吸虫5个虫期线粒体 cytb基因的表达情况并分析对吸虫研究的作用。
　　方法:(1)分别提取斯氏狸殖吸虫囊蚴、30天童虫、60天童虫、成虫、虫卵的mRNA,并反转录为cDNA保存于-20℃。(2)用日本血吸虫线粒体cytb基因设计出斯氏狸殖吸虫的线粒体cytb基因的兼并引物,聚合酶链式反应(PCR)法扩增出斯氏狸殖吸虫cytb基因片段→电泳分离→提纯→连接→转化→挑菌→摇菌→送出测序。用所得的测序结果设计斯氏狸殖吸虫线粒体cytb基因片段的特异引物。(3)用DNAsis等软件分析7种吸虫的线粒体cytb基因,并用树的方式表达它们的亲缘关系。(4)以5个虫期cDNA为模板,特异引物为实验组引物,卫氏狸殖吸虫的18SrDNA基因引物作为内参引物做实时荧光定量PCR(realtime PCR)。根据所获得的结果判断斯氏狸殖吸虫5个虫期线粒体 cytb基因的表达情况并分析与不同虫期虫体致病情况的关系。
　　结果:(1)获得542bp的斯氏狸殖吸虫线粒体cytb基因片段,并将该基因片段纳入NCBI基因库中。根据该基因片段设计出一对斯氏狸殖吸虫线粒体cytb基因片段的特异引物 CytbF:5′GGTTGCTTGATCATAACATTGG3′CytbR:5′GACACTCTGGGTCGACCTTG5′(2)通过在Genebank数据库中Blast发现,斯氏狸殖吸虫的此段cytb序列与日本血吸虫(中国流行区虫种)、异盘并殖吸虫、哈氏并殖吸虫、卫氏并殖吸虫以及斜睾吸虫等有相似性,一共搜索到种7具有同源性的虫种,对7种吸虫线粒体cytb序列利用MEGA4计算遗传距离,采用最大简约法(MP)和邻位相连法(NJ)构建系统进化树, Bootstrap法检验,并Clusterx软件对7种吸虫线粒体cytb序列进行多序列对比,用DNAsis软件对实验所得日本血吸虫和斯氏狸殖吸虫 cytb片段序列进行序列分析,结果显示,用NJ和MP方法构建的遗传系统进化树拓扑结构相似,同时用MEGA4软件对遗传距离进行分析计算上,所得遗传距离远近分布与所得遗传系统进化树结果一致。Realtime PCR结果显示除了虫卵期不见线粒体cytb基因的表达,其他虫期均有表达。
　　结论:1.线粒体cytb基因可作为吸虫遗传进化分类的依据。2.线粒体cytb基因在斯氏狸殖吸虫不同虫期的表达情况与不同时期该虫对宿主的侵袭危害是成正相关的,也为以后的预防,诊断,治疗提供理论依据。

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中文摘要

前言

实验一 斯氏狸殖吸虫线粒体cytb基因片段的扩增、测序，并将其纳入NCBI基因库中。探讨斯氏狸殖吸虫线粒体cytb基因在吸虫分类方面的作用。

1 实验材料

2 实验试剂

3 实验仪器

实验结果

1 PCR扩增结果

2 测序结果

3 根据该基因片段设计出一对斯氏狸殖吸虫线粒体 cytb 基因片段的特异引物 CytbF

4．序列遗传系统进化树构建

实验二 斯氏狸殖吸虫5个虫期cDNA的获得。Realtime PCR法分析斯氏狸殖吸虫5个虫期线粒体cytb基因的表达情况并分析与其致病的关系。

1 实验材料

2 主要试剂

3主要仪器

4 实验方法

结果

1 5个虫期 RNA、cDNA浓度值

2 5个虫期cDNA的PCR扩增结果

2 Realtime PCR 结果

讨论

结论

参考文献

致谢

.综述.

1 吸虫线粒体结构特点

2 吸虫线粒体基因在遗传进化方面的研究

3 吸虫线粒体基因作为药物靶点的研究

4 吸虫线粒体基因在诊断、疫苗方面的研究

5 结语

参考文献