新疆石榴皮植物雌激素物质基础及石榴品种RAPD分析研究

摘要

石榴Punica granatum L.，隶属于石榴科(Puikicaceae)石榴属(Punica)。石榴的干燥果皮是其药用部位，具有涩肠、止血、驱虫的功能，用于久泻、久痢、便血、虫积腹痛。据报道，石榴中含有鞣质类、黄酮类及生物碱类成分，尤其是黄酮类成分以具有植物雌激素的活性而成为研究热点之一。 植物雌激素作为雌激素的替代品，以其安全性及显著的效果，受到越来越多的关注，从天然药物中筛选具有雌激素作用的药物，并进一步筛选其有效成分是实际可行的。针对新疆石榴品种分类相对混乱现象，对现有石榴品种准确鉴定和合理分类是进一步利用石榴资源的基础。 目的： 利用人乳腺癌细胞MCF-7细胞增殖实验与酵母双杂交实验对新疆石榴皮等18种天然药物的植物雌激素作用进行了初步筛选，并对其中具有雌激素活性的新疆石榴皮进行了化学成分的研究。采用分子标记技术和化学分析手段相结合的方法，阐明石榴的分子特征和化学特征，从而为鉴别新疆石榴品种提供实验依据。 方法： 研究内容分为三个部分： 1.采用人乳腺癌细胞MCF-7细胞增殖实验与酵母双杂交(Yeast two-hybrid)实验对新疆石榴皮、罗勒、红景天、阿里红、鹰嘴豆、枸杞、肉苁蓉、琐阳、鼠尾草、当归、川芎、芍药、桃仁、牡丹皮、桂枝、泽泻、白术、茯苓等18种天然药物进行植物雌激素活性的筛选。 2.采用水提取、系统溶剂萃取，分别进行Diaion HP-20、MCI Gel CHP-20、Sephadex LH-20、硅胶等柱层析及制备薄层层析，提取新疆石榴皮样品中的化学成分，并运用HPLC法测定鞣质类成分的含量。 3.选取不同随机引物对不同产地的23个石榴样本进行RAPD指纹图谱分析。 优化RAPD条件后，从中选出多态性高、重复性好的引物对不同样本进行检测，并根据条带的差异进行聚类分析，构建不同石榴品种的RAPD指纹图谱。 结果： 1.MCF-7细胞增殖实验结果表明：当归、川芎、芍药、白术、牡丹皮、鹰嘴豆、新疆石榴皮、罗勒、泽泻、桂枝水提取物可促使ER(+)MCF-7细胞的增殖(P＜0.05)，提示它们具有植物雌激素样活性；酵母双杂交(Yeast two-hybrid)系统实验结果表明：当归、川芎、牡丹皮、鹰嘴豆、石榴皮、泽泻、桂枝、水提取物均能使酵母系统中的β-半乳糖苷酶的活性增强(P＜0.05)，提示它们具有植物雌激素样活性。 2.从新疆石榴皮中提取分离结果得到13个化合物。根据化合物的理化性质及UV、IR、1H-NMR、13C-NMR等波谱方法，鉴定了10个化合物的结构，分别为：没食子酸(gallic acid)、没食子甲酯(methyl gallate)、鞣花酸(ellagic acid)、(+)-儿茶素[(+)catechin]、异槲皮苷(isoquerecitrin)、D-甘露醇(D-mannitol)、熊果酸(ursolic acid)、齐墩果酸(Oleanolic acid)、β-谷甾醇(β-Sitosterol)、胡萝卜苷(Daucosterol)；并运用HPLC方法测定新疆5个石榴主产地中没食子酸含量为疏附县：3.26mg/g、疏勒县：4.53mg/g、叶城：3.86mg/g、皮山县：2.57mg/g、策勒县：2.94mg/g。结果表明不同产地的化学成分的含量具有明显差异。 3.CATB I法提取23份石榴基因组DNA能扩增出清晰的多态性带，确定了适合石榴RAPD反应的反应体系为：10×buffer：2.5μl；dNTP(10mM)：0.5μl；引物(10μM)：5μl：MgCl2(25mmol/l)：0.5μl；Taq DNA聚合酶：0.8μl(2.5μ/μl)；模板DNA(约25ng/μl)：1μl；总体积25μl；剩余的用ddH2O来补充；确定了适合石榴RAPD反应的扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性1min，37℃退火1min，72℃延伸2min，40循环；72℃总延伸7min后在4℃终止反应。 从50个引物中筛选出能稳定扩增的7个引物ZY1、ZY4、ZY12、ZY23、ZY30、ZY41、ZY42，用这些引物对23个石榴品种进行扩增，共扩增出88条带，61条具有多态性，多态性比例为69％。 对新疆石榴23个品种进行了RAPD扩增，根据23个品种的Nei相似系数进行聚类分析的结果：能将23个品种聚为5类：第1类包括库尔勒市甜石榴与喀什市大籽甜石榴等甜石榴品种；第2类是阿图什市酸石榴；第3类包括喀什市阿奇克阿娜尔、叶城酸石榴等酸石榴品种；第4类包括吐鲁番市甜石榴、库车酸甜石榴等种间杂交和来源不详品种；第5类包括皮亚曼石榴和策勒1号等新疆优质石榴品种。本研究结果表明：石榴品种间的遗传多态性有明显差异，即使父母本相同的品种，也能分开。 结论： 1.首次采用人乳腺癌细胞MCF-7细胞增殖实验和酵母双杂交技术，对18种天然药物进行植物雌激素活性的筛选。结果表明新疆石榴皮、罗勒、鹰嘴豆、当归、川芎、芍药、白术、牡丹皮、泽泻、桂枝等7种天然药物的水提物在两种检测方法中均表现出植物雌激素样活性，为今后雌激素类植物资源的开发提供了理论支持。 2.首次对新疆石榴皮进行了化学成分研究，从中分离得到13个化合物，鉴定了其中10个化合物的结构，依次为没食子酸、没食子甲酯、鞣花酸、儿茶素、异槲皮苷、齐墩果酸、熊果酸、β-谷甾醇、胡萝卜苷。所有的化合物均为从新疆甜石榴中首次获得。本研究填补了新疆石榴皮化学成分研究的空白。 3.首次利用HPLC定量方法对5个新疆主产区的石榴样品的没食子酸含量进行了测定，结果显示：5个产区的石榴样品的没食子酸含量不同，其中疏勒县最高为4.53mg/g，皮山县最低为2.57mg/g，这为石榴皮药材全面的质量控制提供了实验依据。 4.借助分子生物学平台，首次采用RAPD指纹图谱技术，对新疆不同产地的石榴进行品种研究，结果表明该技术能较好地用于分析种内或种下样品的遗传距离，为解决种下分类鉴定疑点问题提供DNA分子水平的证据。

目录

论文说明：英文缩略语表

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摘要

前言

第一部分新疆石榴皮等18种天然药物植物雌激素活性筛选实验

1.内容与方法

1.1材料、试剂与仪器

1.2实验方法

2.实验结果

3.讨论

4.小结

第二部分新疆石榴皮化学成分的研究

1.内容与方法

1.1材料、试剂与仪器

1.2实验方法

2.结果

3.讨论

4.小结

第三部分新疆石榴品种资源的RAPD分析

1.内容与方法

1.1材料、试剂与仪器

1.2实验方法

2.结果

3.讨论

4.小结

结论

创新点

致谢

参考文献

石榴研究的概述

附录

攻读博士学位期间发表的学术论文

在读期间主持的课题有：

个人简历