放射治疗对宫颈癌抑制性免疫因素的影响及其调控机制

摘要

目的：（1）通过对宫颈鳞癌和宫颈良性疾病组织、配对血液标本检测，了解血液PD-1、组织PD-L1的表达水平，结合临床资料，评价PD-1、PD-L1与宫颈鳞癌患者预后的关系；（2）以Wistar鼠Hela细胞移植瘤为模型，了解放射治疗对Wistar鼠PD-1、PD-L1、EBI3的影响；（3）通过对Hela细胞系过表达EBI3或抑制EBI3表达，了解与之共培养的T、Treg细胞增殖、凋亡、细胞周期的变化，以及PD-1/PD-L1的变化。
　　方法：（1）收集宫颈鳞癌及宫颈良性病变组织标本各70例，以及配对的外周血鳞癌标本24例，良性病变30例。采用免疫组化法检测组织PD-L1的表达，流式细胞术检测外周血CD4+PD-1+、CD8+PD-1+亚群细胞比例。以上资料与患者的临床病理特征、生存资料做统计分析。（2）对Wistar鼠前肢腋背部接种Hela细胞，建立皮下移植瘤模型，将建模成功的43只大鼠分为放疗组（n=31）和对照组（n=12）。将放疗组给予10Gy6MeV-电子线一次性放疗。放疗组和对照组分别在放疗前、放疗后1周和放疗后1个月采鼠尾静脉血和肿瘤组织。外周血Ficoll分离后，在流式细胞仪上测CD4、CD8计数。取肿瘤组织用免疫组化法测EBI3、PD-1和PD-L1的表达。（3）通过慢病毒质粒转染的方法建立EBI3过表达和EBI3抑制性Hela细胞系，与Wistar大鼠脾脏来源Treg、T细胞共同培养72小时，使用Western Blot法检测EBI3过表达组、EBI3抑制组、阴性对照组、空白转染组细胞中EBI3、PD-1、PD-L1表达水平。使用MTT法，以光密度值比较各组Treg细胞增殖情况。采用流式细胞术检测Treg、CD4+T、CD8+T细胞的凋亡率，CD4+T和CD8+T细胞占CD3+T细胞比率。
　　结果：（1）两组人群除肿瘤家族史外，发病年龄、结婚年龄、孕产次数、初潮年龄、是否绝经、职业、文化程度、民族方面都没有差别。宫颈鳞癌患者外周血PD-1表达量与组织PD-L1表达呈正相关（R2=0.734，P=0.000；R2=0.66，P=0.000）。宫颈良性病变外周血CD4+PD-1+T细胞、CD8+PD-1+T细胞与相应组织PD-L1的表达相关性不大（R2=0.138，P=0.043；R2=0.174，P=0.022）。血CD8+PD-1+T细胞、组织 PD-L1+阳性的细胞数在宫颈肿瘤组与宫颈良性病变组具有统计学差异（P=0.000，P=0.002）。CD8+PD-1表达与是否绝经有统计学差异（卡方=7.152， P=0.012）。肿瘤大小、分化程度、深肌层侵犯、均与外周血PD-1表达程度无关。随肿瘤分期升高，外周PD-1+的CD4+、CD8+细胞百分比也相应升高。随肿瘤直径增大、分期升高，肿瘤组织 PD-L1表达量也相应升高。CD4+PD-1+低表达、组织中PD-L1低表达的患者生存期较长。多因素分析结果显示，组织PD-L1表达对患者生存有影响（B=1.844，P=0.019）。（2）Wistar鼠经过放疗后，肿瘤直径较治疗前缩小，但是放疗后1月部分肿瘤继续生长。Wistar鼠放疗后1月放疗组的CD4、CD8细胞比例较放疗前和放疗后1周明显下降，且明显低于对照组。Wistar鼠 EBI3、PD-1和PD-L1在放疗前、放疗后1周无显著性差异（P＞0.05）。放疗后1月EBI3表达量有明显下降，PD-1和PD-L1有明显增加（P＜0.05）。对EBI3、PD-1、PD-L1表达量和 T细胞数量进行相关性分析提示，EBI3与 CD4+、CD8+细胞数量呈正相关(r=0.723, P<0.001; r=0.413, P=0.021)。相反，PD-1表达量与CD4+、CD8+细胞数量呈负相关（r=-0.631, P<0.001;r=-0.509, P=0.004）。PD-L1表达量也与CD4+、CD8+细胞数量呈负相关（r=-0.606, P<0.001;r=-0.560, P=0.001）。（3）Hela细胞系试验表明，EBI3过表达组EBI3表达升高，PD-1、PD-L1表达下调（P<0.05），EBI3抑制组EBI3表达下降，PD-1、PD-L1表达上升。空白转染组和阴性对照组两组间的PD-1、PD-L1表达水平无显著差异（P>0.05）。EBI3过表达组Treg细胞的OD值升高（0.43±0.05），EBI3抑制组Treg的OD值降低（0.31±0.02）（P＜0.05）。空白转染组和阴性对照组无差异（P＞0.05）。EBI3过表达组、EBI3抑制组、阴性对照组、空白转染组四组在细胞周期方面没有明显差异（P＞0.05），EBI3过表达组Treg、CD4+T、CD8+T细胞凋亡率下降（均P<0.05），EBI3抑制组Treg、CD4+T、CD8+T细胞凋亡率升高（P均＜0.05），相同组内CD4+T的凋亡低于CD8+T（P均＜0.05），四组之间CD4/CD8没有明显差别（P＞0.05）。
　　结论：（1）宫颈鳞癌患者外周血CD4+PD-1+T细胞、组织PD-L1+阳性的细胞增多，且与肿瘤的分级、预后有关，组织PD-L1表达是患者的独立预后因素。（2）放疗能使 Wistar鼠 Hela细胞移植肿瘤缩小，提示Hela细胞移植瘤对放疗敏感。CD4、CD8细胞的比例在放疗后1月明显下降，提示T细胞在放疗后受到抑制。放疗后1月PD-1和PD-L1表达增加，提示放疗可能造成肿瘤局部微环境免疫抑制状态。放疗后1月EBI3表达下降，提示放疗对EBI3表达有影响。（3）过表达EBI3，使PD-1、PD-L1表达下降，Treg凋亡下降，T细胞凋亡下降，反之成立。提示EBI3负向调控PD-1、PD-L1表达，负向调控Treg凋亡及T细胞凋亡。通过对Hela细胞调高或降低EBI3表达，发现Treg细胞周期没有影响，T细胞CD4/CD8比例也没有影响，提示EBI3的功能不包含调控Treg细胞周期或 CD4/CD8细胞比例。（4）放射治疗通过降低宫颈癌细胞 EBI3表达，上调PD-1/PD-L1通路，下调T细胞水平，产生不利的免疫影响；过表达EBI3，可以抑制PD-1、PD-L1表达，减少T细胞凋亡，减弱放疗引起的免疫抑制状态。

目录

声明

中英文缩略词对照表

前言

第一部分 PD-1、PD-L1在宫颈鳞癌与宫颈良性疾病间的表达及预后意义

1 研究内容与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

第二部分 Wistar鼠Hela移植瘤模型接受放疗后PD-1、PD-L1变化的动物实验

1 研究内容与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

第三部分EBI3通过PD-1/PD-L1通路调控宫颈癌Hela细胞免疫抑制的体外研究

1 研究内容与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

结论

全文总结

创新之处

不足之处

展望

致谢

参考文献

综述:在肿瘤组织中的PD-L1、CTLA-4、TIM-3参与的免疫负性调节对免疫逃逸的进展研究

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