次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷医学模型兔的初步研究

摘要

和小鼠相比，兔在生理，解剖，进化等方面和人类更接近；相对于其它家畜，兔饲养成本较少，是研究心血管系统、肺部疾病和代谢疾病的合适动物模型。因此通过基因改造获得人类疾病模型兔在医学研究方面有着良好的应用前景和市场价值。近来，体细胞克隆兔的技术成功建立，使得通过RNA干扰技术或基因打靶技术与体细胞核移植技术的结合来生产定点修饰的转基因兔成为可能。 本论文主要致力于HGPRT基因缺陷医学模型兔的建立，从而为HGPRT基因缺陷引起相关疾病的机理和治疗的研究提供了条件。整个实验分成两部分，第一部分，利用RNA干扰技术，构建了针对HGPRT基因表达的shRNA干扰载体，并将质粒转染兔成纤维细胞，获得携带该干扰片段的转基因细胞系克隆，经PCR鉴定转基因成纤维细胞克隆阳性率为83.3％。RT-PCR及Western-blot检测结果表明转基因干扰成纤维细胞系HGPRT mRNA和蛋白质表达量明显降低。最后以转基因成纤维细胞进行核移植，囊胚率为27.8％，和正常来源的成纤维细胞相比较差异不显著。第二部分，利用Red同源重组系统，首先在已经筛选到含有兔全长HGPRT基因BAC克隆(LBNL1-304M19)的基础上，通过Gap-Repair方式从此克隆上将一段47kb无启动子的HGPRT基因组片段(不含有第1个外显子)克隆到pBACLinkSp质粒上，产生pBACLinkSp-rHGPRT质粒。然后基于pBACLinkSp-rHGPRT质粒，设计不同的同源臂，从而删除了HGPRT基因的不同编码区，成功构建了三个不同的HGPRT基因打靶载体。同时对利用同源重组技术敲除不同大小的DNA片段的效率进行了研究。 本研究发现通过RNAi可稳定敲减兔成纤维细胞HGPRT基因的表达，然后以HGPRTRNAi转基因成纤维细胞为供体细胞进行核移植，证实HGPRTRNAi转基因成纤维细胞能够支持克隆胚发育至囊胚阶段，进一步的胚胎移植正在进行中；利用Red同源重组系统，成功构建了三个不同的兔HGPRT基因打靶载体，HGPRT基因敲除成纤维细胞系的筛选和鉴定正在进行中。基于以上实验，为研究HGPRT在相关疾病中的作用，探索兔成纤维细胞和胚胎干细胞基因打靶的适宜条件，及进一步获得兔HGPRT基因缺陷动物疾病模型奠定了基础。

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文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

第一章引言

1.1 RNA干扰技术及其应用研究进展

1.2同源重组技术研究进展

1.3基因打靶技术的研究进展

1.4本研究工作的内容

第二章应用RNA干扰技术体外抑制HGPRT的表达及其核移植研究

2.1实验材料

2.2实验方法

2.3实验结果

2.4讨论

2.5结论

第三章利用Red同源重组系统构建兔HGPRT基因打靶载体及其在成纤维细胞内重组的初步筛选

3.1实验材料

3.2实验方法

3.3实验结果

3.4讨论

3.5结论

参考文献

附录

致谢

作者简历