牛环形泰勒虫昆明白小鼠繁殖模型与间接荧光抗体检测法的建立

摘要

牛梨形虫病是由泰勒虫和巴贝斯虫引起的一种蜱传血液原虫病的总称（旧称焦虫病），在我国（包括我区）致病率及其危害最严重的是牛环形泰勒虫（Theileria annulata），OIE将其列为B类疫病。多呈急性经过，以高热、贫血、出血、消瘦和体表淋巴结肿胀为特征，急性病例死亡率较高;主要流行于我国西北、华北和东北的一些省、自治区，在我区广泛流行，其感染率可达60％以上，严重威胁养殖牛业的健康发展。因此，将牛环形泰勒虫地方流行株接种于试验动物进行扩繁，研制玻片裂殖子抗原的基础上，建立准确、灵敏、快速的间接荧光抗体检测方法(IFAT)等，对该病的早期诊断、流行病学研究和综合防治提供技术支持。
　　(Ⅰ)本试验研究，对同胎、体重20g左右、雌雄对半的40只昆明白小鼠进行摘除脾脏的手术，并以被去除脾脏的昆明白小鼠为实验动物，接种牛环形泰勒虫地方流行株，进行体内扩繁试验(invivo)，并每隔8h、12h、24h、8h及3d～10d观察分析其染虫率，在小鼠体内扩繁情况等;经小鼠心脏、眼球采血的方法收集其最高染虫率（15％以上）的血液内裂殖子，并进行冻存，摸索其保存、复苏条件等。试验结果显示，术后有37只鼠存活，检测其呼吸、心跳、食欲、精神状态皆良好，说明摘脾手术成功;接种后的第2d可在小鼠血液里观察到裂殖子，第5d～9d每组小鼠的平均染虫率可达15％～20％（最高峰），第10d后染虫率开始下降，渐渐在血液涂片中观察不到裂殖体;经试验发现牛源性环形泰勒虫在除脾脏昆明白小鼠体内能被置换、增值;在雌雄昆明白小鼠体内的扩繁率差异极显著(P=0.007＜0.01)，而去脾昆明白与未去脾昆明白小鼠的染虫率极显著(P=0.0002＜0.01);染虫率为15％以上时的昆明白小鼠血液里的裂殖子可用冷冻法（-80℃）保存，亦可制作玻片裂殖子抗原备用，保存后的半年内的裂殖体复苏活性良好。该试验数据可为建立牛环形泰勒虫动物模型，为教学、科研提供丰富的虫株资源。
　　(Ⅱ)本试验研究，应用阳性牛环形泰勒虫病例的血液源性裂殖子和经昆明白小鼠扩繁的裂殖子（试验Ⅰ方法制作的玻片抗原，保存于-80℃备用）作为已知抗原，经十字交叉法分别将一抗(1∶20～1∶640)和二抗（1∶20～1∶1600）梯度稀释，摸索和确其最佳工作浓度，建立牛环形泰勒虫病的间接荧光抗体检测方法(IFAT);经特异性（观察其与牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫是否有交叉反应）、重复性试验等验证其重复性及灵敏度，并运用所建立的方法对疑似牛环形泰勒虫抗体样品(n=290)进行了检测。试验结果显示:自制的牛环形泰勒虫玻片裂殖子抗原在-80℃条件下能保存半年之久，复苏后仍然具有较好的抗原性;牛环形泰勒虫间接荧光抗体检测方法的一抗（被检血清）和二抗（荧光标记兔抗牛IgG）最佳工作浓度分别为1∶80和1∶100稀释度;该方法检测样品，与牛巴斯虫、双芽巴贝斯虫未出现交叉反应;被检测血清稀释到1∶1600仍然可以检测到裂殖子荧光;批内和批间重复检测，变异系数均小于10％;应用所建立的方法成功检测了采自疑似区牛被检血清样品290份，阳性率为72.4％(210/290)，本次牛环形泰勒虫的检出率高于血液涂片染色镜检法(阳性率为27.6％(80/290)。本试验研究可为牛环形泰勒虫病的诊断提供玻片裂殖子抗原资源;所建立的IFAT方法，其敏感性较高、特异性和重复性较好，可用于该病的早期诊断，可为综合防控奠定基础。

目录

声明

摘要

第1章 环形泰勒虫病的研究进展

1．1 病原形态

1．2 生活史

1．3 流行病学

1．4 流行病学

1．5 病理变化

1．6 诊断技术

1．7 治疗

1．8 预防

1．9 血液原虫动物模型的研究进展

1．10 本研究的目的和意义

第2章 牛环形泰勒虫新疆流行株(裂殖子)的扩繁及其接种试验

2．1 实验材料

2．2 试验方法

2．3 试验结果

2．4 讨论与小结

第3章 牛血源性环形泰勒虫玻片裂殖子抗原的研制及间接荧光抗体检测法的建立

3．1 试验材料

3．2 试验方法

3．3 试验结果

3．4 讨论与小结

第4章 结论

参考文献

附录

致谢

作者简历