新疆奶牛部分养殖区牛病毒性腹泻病毒隐性感染调查及分子流行病学研究

摘要

牛病毒性腹泻（Bovineviraldiarrhea，BVD）是由牛病毒性腹泻病毒（BVDV）引起的，主要侵害牛、羊、鹿、牦牛等反刍动物及猪的一种重要传染病。该病的隐性感染以持续感染和免疫耐受为特点，持久带毒、排毒，成为常在传染源，是造成BVDV广泛传播的重要因素。随着高产奶牛的大量引进，新疆奶牛BVDV感染严重，尤其是隐性感染所造成的危害不被人所知。因此，本研究从隐性感染的分子流行病学出发，分析新疆BVDV主要流行株和系统进化关系，从而对BVDV的防疫做到有的放矢，最终获得可靠的免疫效果。 本实验以RT-PCR技术为研究方法，参照多株不同基因型和基因亚型牛病毒性腹泻病毒（BVDV）5'UTR相对保守的基因序列，设计3对引物，其中外侧引物F1\F2能够扩增不同基因型BVDV5'UTR片段（288bp），内侧引物P1\P2和P3\P4分别能够扩增BVDV-1型和BVDV-2型5'UTR片段（195bp和116bp）。经过对PCR反应条件进行优化，建立了一种特异、敏感的巢式RT-PCR检测方法，敏感性为10-3TCID50/100μL。对猪瘟兔化弱毒疫苗株、牛轮状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒的检测结果均为阴性。本方法即用于基因分型又可区别其它瘟病毒属成员，大大提高了灵敏性和特异性，能够快速、简便、高特异性和高灵敏度的诊断BVDV感染的奶牛。 应用已建立的巢式RT-PCR检测方法对采自新疆4个不同地区8个牛场的302份全血样品进行核酸检测及测序。结果表明：BVDV平均阳性率为43.39％。其中有101对为母子对应样品，母牛BVDV感染率为44.89％，犊牛BVDV感染率为56.19％，数据显示犊牛比母牛易感。测序得到27条序列，经核酸序列同源性比较和系统发生分析表明，26株病毒与VEDEVAC亲缘关系最近，同源性达96.2-100％，属于BVDV-1b基因亚型，只1株为BVDV-1c亚型，未检测到BVDV-2型。提示新疆BVDV流行株为BVDV-1b亚型，同时有BVDV-1c亚型共存。 应用BVDV的生物型检测方法对27个已经测序的BVDV阳性样品鉴定生物型。接种于MDBK细胞，观察其是否发生细胞病变。结果表明：所有27个BVDV分离株都表现为ncp型，表明新疆BVDV分离株主要为ncp型。有关报道表明，这种生物型是分离株中最普遍的，而且以病毒的垂直传播为特点。所分离的27株病毒中有8对为母子对应样品，提示其犊牛发病可能由垂直感染引起。通过以上研究表明，新疆BVDV主要流行株为BVDV-1b亚型，同时BVDV-1c亚型共存，且都为ncp型病毒。

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引言

第一章文献综述

1 BVDV的病原学

1.1 BVDV的发现与命名

1.2BVDV基因组

2 BVDV的流行病学

2.1国内外BVDV流行情况

2.2 BVDV分子流行病学

3 BVDV的生物型及毒力

4cp型BVDV与ncp型BVDV之间转化的机制

4.1外源细胞序列插入病毒基因组

4.2病毒自身的基因发生重排和拷贝

4.3缺陷干扰粒子(defective interference,DI)

4.4点突变

5流行原因分析

6 BVDV致病机理

6.1持续感染与免疫耐受

6.2粘膜病

6.3繁殖障碍

6.4免疫抑制

6.5血小板减少症

7 BVDV诊断技术研究进展

7.1抗体诊断

7.2抗原诊断方法

8本课题要解决的问题及意义

第二章试验研究

试验一BVDV巢式RT-PCR检测方法的建立

1材料与方法

2 方法

3结果

4讨论

试验二BVDV的基因分型和系统进化分析

1材料与方法

2 结果

3 讨论

试验三BVDV分离株的生物型鉴定

1材料

2方法

3结果

4 讨论

结论

创新点

参考文献

附录

致谢

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