枯草芽孢杆菌S44菌株ituD基因克隆、表达及其脂肽类抗生素生物活性研究

摘要

目的：为了明确枯草芽孢杆菌S44防治植物病害及抑制病原菌生长的机理，通过特异性引物PCR扩增技术克隆ituD基因，并对ituD基因进行了原核表达。明确枯草芽孢杆菌S44产IturinA。通过进一步发酵提取与该基因密切相关的脂肽类粗提物，对其抑菌活性、理化性质、作用机制及发酵工艺进行研究，进而提高脂肽类抗生素的产量，最终使枯草芽孢杆菌S44发挥更好的防病效能。
　　方法：通过特异性引物PCR扩增技术进行ituD基因的克隆与原核表达；通过浓盐酸沉淀、甲醇抽提法提取iturin粗提物，采用平皿对峙法测定其抑菌活性及理化性质，并观测粗提物对病原菌菌丝生长和孢子萌发的影响；通过单因素实验和响应面分析相结合的统计方法优化获iturin粗提物最大产量的发酵工艺。研究结果如下：
　　结果：1、本研究通过特异性引物PCR扩增技术克隆了枯草芽孢杆菌S44菌株ituD基因，序列分析表明，该基因全长为1203bp，编码400个氨基酸，与已报道的ituD氨基酸序列同源性为85％。同时构建了原核生物表达载体pET28a（+）-ituD，对不同的IPTG诱导浓度和诱导时间等条件的优化结果表明，37℃6h能诱导ituD融合蛋白的最大量表达,在0.5mmol/LIPTG浓度下可以成功表达出ituD蛋白。为进一步研究其表达蛋白的生物学机制、功能及其与iturinA的合成奠定基础。
　　2、通过甲醇抽提法获得脂肽粗提物，用平皿对峙法分别检测枯草芽孢杆菌S44的iturins粗提物对番茄早疫病菌、大豆立枯丝核菌、棉花黄萎病菌、西瓜枯萎病菌及瓜果腐霉病菌5种供试病原菌的抑菌活性。结果表明，该粗提物对番茄早疫病菌的抑菌效果最好，对西瓜枯萎病菌、大豆立枯病菌及棉花黄萎病菌次之。
　　3、枯草芽孢杆菌S44的iturins粗提物在紫外灯下分别照射1h、2h和4h及在自然光下照射3h、6h和12h；在60℃、80℃、100℃（电热恒温水槽内进行）、121℃（高压锅内进行）条件下处理30min，表现出了良好的耐受紫外线照射和耐热性。iturins粗提物在pH范围以及乙醚、异丙醇、乙酸乙酯、丙酮和氯仿5种有机溶剂处理条件下表现出了很好的酸碱稳定性和耐有机溶剂的特性；该粗提物对蛋白酶K处理不敏感。上述特征进一步表明该粗提物为一种脂肽类物质。
　　4、随着稀释倍数的增大，粗提物抑菌活性逐渐降低，稀释64倍后，粗提物抑菌效果不明显。用粗提物处理的番茄早疫菌菌丝形态变化显著，菌丝断裂、顶端膨大、肿胀畸形；细胞膜破裂、原生质释放；粗提物对孢子具有强烈的抑制作用，孢子变畸形，抑制孢子萌发。
　　5、将iturins粗提物纯化，经反相HPLC与标准品进行比对，结果显示样品的主峰与标准品IturinA的一特征峰保留时间基本一致，因此样品含有IturinA的组分。
　　6、用PD、PS、YPG和Landy四种不同培养基发酵枯草芽孢杆菌S44，初步确定采用PD和YPG培养基发酵，发酵产物中脂肽粗提物产量较高，对番茄早疫病菌、大豆立枯丝核菌、棉花黄萎病菌、西瓜枯萎病菌4种供试病原真菌的抑菌圈最大。以PD和YPG培养基通过响应面方法来确定获得脂肽粗提物最大产量的培养方式进行脂肽粗提物的制备，通过对模型的拟合分析得到采用YPG和PD两种培养基发酵时，最佳接种量分别为3.08%和3.2%，摇培时间分别为60.49h和64.80h，脂肽粗提物干重最大量分别达到0.98mg/mL和0.68mg/mL。

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引言

第一章 文献综述

1.1国内外枯草芽孢杆菌的应用概况

1.2枯草芽孢杆菌中脂肽抗生素的研究

1.3 伊枯草菌素A（Iturin A）的研究

1.4 论文研究的意义

第二章 材料与方法

2.1 试验材料

2.2 试验方法

第三章 枯草芽孢杆菌S44菌株ituD基因的克隆与表达枯草芽

3.1结果分析

3.2 小结

第四章 Iturins粗提物性质及作用机理初步研究

4.1结果与分析

4.2 小结

第五章 iturins粗提物发酵工艺优化

5.1结果与分析

5.2 小结

第六章 总结与讨论

参考文献

附录1 脂肽粗提物理化性质测定部分试验图片

致谢

作者简介

石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表