重组羊类泛素ISG15蛋白对盘羊杂交羊感染绵羊肺炎支原体免疫调节及治疗效果的研究

摘要

目的:本实验以感染绵羊肺炎支原体的绵羊为动物疾病模型,使用重组的类泛素ISG15蛋白治疗感染绵羊肺炎支原体的盘羊杂交羊,然后用荧光定量PCR与ELISA的方法,测定各种细胞因子的表达变化,分析ISG15蛋白的先天性免疫调节和治疗作用。
　　方法:(1)将冻存的绵羊肺炎支原体分离株增殖培养,测定菌液浓度并稀释到人工感染的浓度,然后将18只盘羊杂交羊随机分为A、B、C三个组,6只巴什拜羊为D组,全部气管内注射绵羊肺炎支原体,每天观察临床症状并检测体温,两周后,用无菌咽拭子随机采取各组试验羊的鼻腔分泌物,进行绵羊肺炎支原体培养与生化鉴定,检测动物人工感染情况。(2)在试验的第五天(5d),将人工感染绵羊肺炎支原体的羊使用纯化的蛋白对其治疗,其中A组和D组每天注射生理盐水;B组使用盘羊杂交羊的重组ISG15蛋白治疗,200μg/只·天,C组使用巴什拜羊的重组ISG15蛋白治疗,200μg/只·天,每天观察临床症状,检测体温;将死亡的患羊剖检观察肺脏病理变化,对比各组羊在治疗后的差别。(3)分别在感染前一天(0d)、感染后一天(1d)、感染后五天(5d)、一周(7d)、两周(14d)、三周(21d),采集新鲜的抗凝血,分离淋巴细胞。最后用荧光定量PCR检测试验羊血液中ISG15、IFN-γ、IL-12的表达水平,观察比较各组羊细胞因子的表达变化差异。(4)分别在感染前一天(0d)、感染后一天(1d)、感染后五天(5d)、一周(7d)、两周(14d)、三周(21d),采集新鲜的血液,析出血清,然后使用ELISA方法检测试验羊血清中IL-2、IL-4、IL-6的表达水平,观察比较各组羊细胞因子的表达变化差异。
　　结果:(1)鼻腔分泌物的支原体培养物可使支原体专用培养基变黄,葡萄糖发酵试验、美蓝还原试验、红细胞吸附试验均为阳性,水解精氨酸试验、分解尿素试验均为阴性,溶血试验为β溶血,所有羊在感染后均出现了不同程度的发烧、咳嗽、食欲下降、腹泻等症状。说明全群人工感染成功。(2)没有治疗的A组盘羊杂交羊死亡3只,死亡率50％,D组巴什拜羊表现正常,B、C组治疗组没有羊死亡,但均有不同程度的咳嗽,流脓性鼻液,剖检后肺脏均有不同程度的出血点及出血斑。(3)在感染后的第1d,各组羊的IFN-γ表达水平与攻毒前略有下降,但第14d,B组显著高于A、D组(P<0.05),第21d,B和C组显著高于A和D组(P<0.05),治疗后IFN-γ的水平升高,说明各组羊的抵抗力增加;ISG15的表达量在第14d与21d,B、C、D组的表达水平显著高于A组(p<0.05),治疗后B、C组ISG15表达水平比不治疗的A组显著升高,说明其抗病力与免疫调节能力增强;在感染后的第14d和21d,A组的IL-12表达水平显著高于其它各组(P<0.05)。(4)各组羊在感染前IL-2的表达量基本一致,D组在感染后第5d显著低于A、B、C组(P<0.05);在感染后第7d,B、C组显著高于A组(P<0.05),说明B、C组在治疗后抵抗力增加;感染后第14d与第7d相比,A组开始升高,D组开始降低,B、C组表达量没有明显变化,说明治疗后B、C组IL-2的表达量较A、D组稳定,治疗后其提高的抵抗力持续较久。IL-4的表达水平在感染后第7-21d,B、C组显著高于A、D组(P<0.05),说明在治疗后B、C组体液免疫能力增强。D组的表达量变化不大。在7-21dA组羊IL-6的表达量比B、C、D组显著升高(P<0.05),并保持在较高水平,说明A组羊的炎症程度较高,治疗组的炎症有改善。
　　结论:使用重组的ISG15蛋白对易感的盘羊杂交羊治疗后,杂交羊对照组死亡率50%,治疗组没有死亡;杂交羊治疗组IFN-γ、ISG15、IL-12、IL-2表达水平在治疗后显著高于对照组,提高了抗病能力;杂交羊治疗组IL-6表达水平在治疗后显著低于对照组,改善了炎症状况。说明ISG15蛋白具有一定的免疫调节及治疗效果,为绵羊支原体肺炎临床治疗和新药的研发提供新的理论依据。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

缩写的中英文对照

引言

文献综述

1 ISG15基因的研究进展

2 绵羊肺炎支原体研究进展

3 相关细胞因子研究进展

4 荧光定量PCR的研究进展

5 ELISA的研究进展

试验一 绵羊肺炎支原体的人工感染

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

实验二 ISG15蛋白对感染绵羊肺炎支原体羊的治疗作用

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

试验三 荧光定量PCR检测ISG15蛋白对盘羊杂交羊感染肺炎支原体的免疫调节作用

1材料与方法

2 结果

3 讨论

试验四 ELISA方法检测ISG15蛋白对盘羊杂交羊感染肺炎支原体的免疫调节作用

1材料与方法

2 结果

3 讨论

全文总结

创新点

参考文献

附录

作 者 简 介