微拟球藻丙二酰CoA:ACP转酰基酶基因克隆及环境胁迫条件下脂肪酸组成变化研究

摘要

微拟球藻(Nannochloropsis ganada)在物种分类上被划归为褐藻门、大眼藻纲、单细胞藻类。其油脂含量最高可达占干重的60％左右，脂肪酸组成主要为C16和C18类。该藻被学者认为是最有希望用于生产油脂的海水藻。但目前关于其基因工程产油方面的研究还较少。本研究主要内容包括：
　　⑴针对微拟球藻不同生长时期转录信息的差异，运用Illumina高通量测序技术中的HiSeq2000平台，选择在不同生长时期的微拟球藻进行转录组学分析，然后从转录组文库中获得油脂合成过程中的关键基因—丙二酰CoA:ACP转酰基酶基因片段，利用Race技术获得该基因全长，并分析了微拟球藻(Nannochloropsis ganada)在不同生理状态下脂肪酸组成及MCAT基因的转录表达变化。
　　⑵转录组学研究表明：在微拟球藻(Nannochloropsis ganada)生长的指数期和平台期共获得29,203条高质量mRNA序列片段。在指数期，有9,745条mRNA序列表达上调，而在平台期有7,305条mRNA序列表达上调。指数期和平台期表达无差异的序列总共有12,153条。在NCBI数据库中，获得注释信息的序列有13,775条。而KEGG代谢通路数据库注释表明：指数期获得了238条代谢途径注释，其中有818条序列在这些代谢途径中表达上调。平台期获得了248条代谢途径注释，其中有1,148条序列表达上调。在COG数据库中有11604条序列（25亚类）获得注释。这些注释主要涉及脂质代谢、糖代谢、光合作用等等诸多生理生化过程。其中，指数期表达上调4,135条序列，在平台期表达上调5,015条序列。
　　⑶克隆结果表明：微拟球藻丙二酰CoA:ACP转酰基酶基因5`-UTR为158bp，3`-UTR为452bp，编码蛋白区长度为1059bp，NgMCAT基因编码352个氨基酸，编码蛋白的分子量为37.22 kDa，等电点为6.06。系统进化树及氨基酸序列同源性分析发现微拟球藻丙二酰CoA:ACP转酰基酶的氨基酸序列和三角褐脂藻、海链藻等藻类丙二酰CoA:ACP转酰基酶氨基酸序列具有较高相似性。Real-time PCR结果表明：在富氮培养时，NgMCAT表达水平的变化不显著；而在缺氮条件下，NgMCAT的表达量在初始的12h内，逐渐增大，在12h时表达量最高，为初始0h的5.17倍。但从12h往后，NgMCAT表达量则逐步降低。在72h时候，NgMCAT基因的表达量仅为对照组0h的0.47倍，在12h时表达量达到最大值，为对照组0h的2.35倍。在低温下(15℃)下培养，NgMCAT表达量先急剧增加，在6h表达量最高，为0h的4.25倍。而后，随着培养时间的延长，NgMCAT的表达呈降低趋势，并且在36h及72h均低于正常培养时该基因的表达量。其中，NgMCAT在72h表达量最低，为0h的0.75倍。在富盐培养状态下，NgMCAT的转录水平呈现先上升后下降的趋势。
　　⑷在正常培养及富盐培养条件下，微拟球藻(Nannochloropsis ganada)脂肪酸组成中的C14:0, C16:1, C20:4, C20:5随着培养时间的延长而逐渐上升，但是，C16:0, C18:2, C18:1, C18:0等组分则表现出相反的趋势。在低温培养条件下，C14:0组分呈波动变化，而高温下则表现出先升高后降低的趋势，其组分含量最大值在24h。在低温及高温条件下，C16:0组分均表现很出随着培养时间延长而逐渐降低的趋势。但是在低温条件下降低速度更快。C18:0在低温及高温下均表现出先降低而后略微上升的趋势；在富氮条件下，C18:0表现出上升趋势；而在缺氮条件下，则表现出下降趋势。在限氮条件下，C16:1的含量随着培养时间的延长表现出显著的增长趋势；而C18:0和 C20:4这两类组分则在富氮条件下随培养时间延长而增长，而在缺氮条件下则表现出随培养时间延长而降低的趋势。在缺氮和富氮条件下，C20:5均表现出下降趋势，但在缺氮条件下，其下降速率表现的更为明显。

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第一章 文献综述

1.1 微藻研究进展

1.2 影响微藻生长和油脂积累的环境因素

1.3 微藻油脂代谢基因工程研究进展

1.4 转录组学研究进展

1.5 课题研究目的和意义

1.6技术路线

第二章 微拟球藻不同时期转录组差异文库的构建

2.1 材料

2.2 方法

2.3结果

2.4讨论

第三章 微拟球藻丙二酰CoA:ACP转酰基酶基因的克隆及环境胁迫响应分析

3.1材料

3.2 方法

3.3结果

3.4 讨论

第四章 不同培养条件对微拟球藻脂肪酸组成的影响

4.1材料

4.2方法

4.3结果

4.4 讨论

第五章 全文总结

5.1转录组学方面

5.2 NgMCAT克隆转录方面

5.3油脂变化方面

参考文献

致谢

作者简介

石河子大学硕士研究生学位论文