巴贝斯虫RAP-1C基因的克隆、表达及双芽巴贝斯虫病间接ELISA诊断方法的建立

摘要

巴贝斯虫病(Babesiosis)是由巴贝斯科、巴贝斯属的多种巴贝斯虫寄生于脊椎动物红细胞所引起的一类疾病的总称,以高热、贫血、黄疸和血红蛋白尿为临床特征,常可导致发病动物死亡,严重威胁着畜牧业的发展和人类健康。牛巴贝斯虫病是由牛的巴贝斯虫(Babesia spp)所引起的一类血液原虫病,其中牛巴贝斯虫(Babesia bovis)和双芽巴贝斯虫(Babesia bigemina)是分布最广、危害最为严重的两种病原,由于二者均以微小牛蜱(Boophilus microplus)为传播媒介,常呈混合感染,临床上较难区分,给该类疾病的诊断带来较大的困难。因此,开展该病的鉴别诊断研究具有重要的意义。
　　本研究通过对双芽巴贝斯虫和牛巴贝斯虫的棒状体相关蛋白1(Rhoptry-associated Protein-1,RAP-1)基因的羧基端进行克隆、表达,在对重组蛋白反应原性及特异性进行分析的基础上,初步建立了针对双芽巴贝斯虫感染的间接 ELISA诊断方法,利用田间血清样品对本法进行了评价。本文的主要研究内容如下:
　　1.双芽巴贝斯虫和牛巴贝斯虫RAP-1C基因的序列分析、克隆与表达
　　利用生物信息学软件对双芽巴贝斯虫和牛巴贝斯虫 RAP-1基因进行比对和抗原表位预测,发现二者羧基端相似度较低且均具有明显的抗原表位区。针对双芽巴贝斯虫和牛巴贝斯虫RAP-1基因羧基端(分别为第313-484位和第317-537位氨基酸)设计特异性表达引物,克隆出双芽巴贝斯虫和牛巴贝斯虫RAP-1C基因,构建了二者的重组表达质粒,最后成功进行了原核表达,分别表达出大小为26 ku和31.9 ku的重组蛋白。
　　2.双芽巴贝斯虫和牛巴贝斯虫RAP-1C重组蛋白的纯化与反应原性检测
　　利用Ni-NTA试剂盒对重组蛋白进行了纯化,纯化后的双芽巴贝斯虫和牛巴贝斯虫RAP-1C重组蛋白浓度分别为0.4 mg/mL和0.8 mg/mL。对两种融合蛋白进行Western-blot分析,结果显示二者均与相应牛阳性血清反应,但双芽巴贝斯虫RAP-1C蛋白与牛巴贝斯虫阳性血清之间无交叉反应,牛巴贝斯虫RAP-1C蛋白与双芽巴贝斯虫阳性血清之间无交叉反应。此外,两种融合蛋白与大巴贝斯虫阳性血清、瑟氏泰勒虫阳性血清和环形泰勒虫阳性血清均无交叉反应。
　　3.双芽巴贝斯虫病间接ELISA诊断方法的建立
　　利用纯化的双芽巴贝斯虫RAP-1C蛋白初步建立了间接ELISA方法,并对该方法进行了优化,经MedCalc软件分析20份阴性血清和90份阳性血清的检测结果,确定 OD450值等于0.6363为该方法的阳性阈值,其敏感性和特异性分别为95.5％和100%,并且与牛其他主要梨形虫无交叉反应。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

中英文缩略词表

目录

第一章 文献综述

1 病原生物学

2 巴贝斯虫研究进展

3 巴贝斯虫检测技术研究现状

第二章 实验研究实验一 双芽巴贝斯虫和牛巴贝斯虫RAP-1C基因的序列分析、克隆与表达

1材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 双芽巴贝斯虫和牛巴贝斯虫RAP-1C重组蛋白的纯化与反应原性检测

1 材料

2方法

3 结果

4 讨论

实验三 双芽巴贝斯虫病间接ELISA诊断方法的建立

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

全文结论

参考文献

致谢

作者简介

在校期间参与的研究课题

论文发表情况