松鼠葡萄球菌mecA和金黄色葡萄球菌mecA在松鼠葡萄球菌耐药机制及细胞壁合成中的作用

摘要

金黄色葡萄球菌是引起医院内获得性感染和社区获得性感染的重要致病菌之一。β-内酰胺类抗生素曾经是治疗金黄色葡萄球菌感染的有效武器，但随着耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(Methicillin resistant Staphylococcus attreus，MRSA)分离率的逐渐增加，金黄色葡萄球菌引起的感染成为临床上非常棘手的问题。耐药的主要决定基因为 mecA。mecA编码的青霉素结合蛋白2A(penicillin-bindingprotein 2A，PBP2A) 对β-内酰胺类抗生素亲和力很低，当固有的PBP被β-内酰胺类抗生素饱和时，PBP2A可替代这些PBPs的转肽功能催化细胞壁合成。mecA基因并非金黄色葡萄球菌的固有基因，而是一外源基因，其来源有很多假设，目前认为是从松鼠葡萄球菌中获得。大多数松鼠葡萄球菌的mecA并不提供抗药性，但把活化的松鼠葡萄球菌mecA引入到敏感的金黄色葡萄球菌可使后者的抗药性大大增加，松鼠葡萄球菌的mecA基因产物能够利用金黄色葡萄球菌的细胞壁前体合成金黄色葡萄球菌的细胞壁。最近，我们分离到了既含有松鼠葡萄球菌的mecA又含有金黄色葡萄球菌的mecA的松鼠葡萄球菌K3，K3为黄色菌落，在没有抗生素存在时能自发分化为K3y(黄色菌落)和K3w (白色菌落)。前者表型和基因型与亲代菌完全相同，后者仅含有松鼠葡萄球菌mecA而丢失了金黄色葡萄球菌的mecA。本论文将针对这两个mecA基因在松鼠葡萄球菌的耐药性及细胞壁合成中的作用进行研究。 目的：进一步研究松鼠葡萄球菌的生物学特征和基因特征以期更深入的理解金黄色葡萄球菌耐药性基因mecA来源以及MRSA菌株的耐药机制：同时，认识临床上分离率日益增加的松鼠葡萄球菌的耐药机制。 方法：通过抗生素压力选择出松鼠葡萄球菌K3的高度均一耐药株；应用E-test和PAP 试验来检测松鼠葡萄球菌对苯唑西林的耐药性；PCR扩增两个mecA基因并制备DNA探针；多重PCR 用于菌株K3和K8的SCCmec 分型；应用 Northem blot 和 Western blot分别检测两个mecA基因在转录水平和蛋白质水平上的表达；通过克隆和测序排布出敏感菌 K1 及耐药菌K3 orfX 区的基因分布，与GenBank中的同源序列进行比较并分析其特征；Sma I消化染色体DNA后，脉冲场电泳分离消化产物，Southem blot检测orfX和mecA在染色体上的位置关系；分离、纯化细菌膜蛋白后应用PBP assay鉴定出松鼠葡萄球菌的青霉素结合蛋白图谱以及各个PBPs对β-内酰胺类抗生素的亲和力；分离、纯化细胞壁，高压液相法分析细胞壁成分。 结果：经过抗生素选择压力，筛选出 K3 的 homo<'*> 衍生菌 K3HO，K3HW。K3HWO。K3 对苯唑西林呈异质性耐药，K3 homo<'*> 衍生菌对苯唑西林高度均一耐药，MIC>400μg/ml。在抗生素存在的情况下，K3自发分化为K3w和K3y的现象被抑制，分化出的黄，白菌落均含有松鼠葡萄球菌mecA和金黄色葡萄球菌mecA。同时，金黄色葡萄球菌的mecA被大量诱导，但Northem blot检测不到松鼠葡萄球菌mecA的表达。K3 homo<'*>衍生菌的金黄色葡萄球菌mecA表达轻微提高，但也未能检测到松鼠葡萄球菌mecA在RNA水平的表达。K3和K8分别为SCCmec ⅢB和SCCmec ⅢA型，SCCmec准确的插入到orfX区。K1和K3 orfX区的基因排布和表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌相似而和金黄色葡萄球菌差异较大。orfX和mecA基因在染色体上的位置随菌株不同而不同。鉴定了6种PBPs，其中PBP4 即为松鼠葡萄球菌mecA的表达产物，对苯唑西林呈低亲和力。PBP6在苯唑西林耐药性方面可能发挥了重要作用。苯唑西林耐药菌细胞壁交联率高于敏感菌，但交联率的高低和菌株的MIC值并不呈线形关系。在抗生素压力下，金黄色葡萄球菌的mecA产物能利用松鼠葡萄球菌细胞壁合成前体合成松鼠葡萄球菌的细胞壁。 结论：在两个mecA共存的松鼠葡萄球菌中，金黄色葡萄球菌mecA和抗药性直接相关，但也不能排除松鼠葡萄球菌mecA的作用。orfX和mecA位于基因重组的热点或附近，这有利于松鼠葡萄球菌获得新的SCCmec或松鼠葡萄球菌mecA的转移。松鼠葡萄球菌细胞壁的高度交联率和耐药性相关，这不同于敏感和耐药的金黄色葡萄球菌细胞壁特征。松鼠葡萄球菌的mecA和金黄色葡萄球菌mecA在细胞壁的合成中具有相互替代性。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

论文研究的核心内容

前 言

文献综述

材料与方法

1.菌株与质粒

2.生长条件

3.抗生素敏感试验

4.homo*的产生

5.DNA方法

6.PCR

7.脉冲场电泳(Pulse-field gel electrophoresis，PFGE)

8.RNA的制备及Northern blot

9.膜蛋白的制备

10.Western blotting

11.青霉素结合蛋白分析

12.肽聚糖的制备及细胞壁成分分析

13.克隆基因的GenBank代码

结 果

1.松鼠葡萄球菌耐药表型研究

2.K3菌中两种mecA在苯唑西林耐药性中的作用

3.苯唑西林敏感和耐药的松鼠葡萄球菌中orfX区的分子克隆

4.松鼠葡萄球菌的青霉素结合蛋白图谱

5.松鼠葡萄球菌细胞壁的合成

6.金黄色葡萄球菌mecA介导的松鼠葡萄球菌细胞壁合成

讨论

1.松鼠葡萄球菌分离株耐药表型及基因型研究

2.两种mecA在K3菌抗生素耐药性中的作用

3.苯唑西林敏感和耐药的松鼠葡萄球菌中orfX区的分子克隆

4.松鼠葡萄球菌的青霉素结合蛋白

5.苯唑西林敏感和耐药的松鼠葡萄球菌细胞壁组成分析

6.两种mecA基因在细胞壁合成中的可替代性

结 论

参考文献

发表论文

致 谢