牛奶、鸡蛋过敏原的鉴定、纯化及应用研究

摘要

目的：食物过敏是当今重大的卫生学问题，食物过敏原的鉴定、纯化、和标准化是食物过敏性疾病预防和治疗的中心环节。本研究以牛奶、鸡蛋中的过敏原为研究对象，以过敏患者血清中的特异性抗体为探针，对牛奶和鸡蛋中的过敏原组分进行鉴别，并设法将其纯化，作为原料制备包被抗原和酶标抗原，建立食物过敏的双抗原夹心酶免疫检测法，并对其临床应用性能进行考察，为食物过敏诊断试剂的改善和国产化提供实验依据。
　　 方法：⑴血清收集：从天津市儿童医院检验科收集鸡蛋、牛奶过敏的阳性患者血清及正常对照血清。⑵牛奶/鸡蛋过敏原组分的鉴定：提取牛奶/鸡蛋中的总蛋白成分，经SDS-PAGE观察蛋白条带，以牛奶/鸡蛋过敏血清中的特异性抗体作为探针，通过免疫印迹实验鉴定其中的过敏原组分。⑶牛奶/蛋清过敏原组分的纯化：在鉴定工作的的基础上，通过去脂、等电点沉淀、盐析、凝胶层析、超滤等手段设法对牛奶/蛋清中的蛋白进行分离和纯化，提取出主要的过敏原组分，并进一步验证致敏性。⑷牛奶过敏特异性抗体的双抗原夹心酶免疫检测法的建立：通过ELISA考察牛奶过敏原组分的致敏性，将其进行合理配比制备包被抗原，同时对过敏原组分进行辣根过氧化物酶标记，制备酶标抗原，建立双抗原夹心法检测模式，摸索最佳工作浓度和反应条件。⑸双抗原夹心酶联免疫法检测牛奶过敏特异性抗体的初步临床应用：以目前临床应用的进口食物过敏检测试剂作为参考方法，与本实验建立的双抗原夹心法进行比较，测定同一批临床收集的血清标本，计算检测的灵敏度、特异度和阴阳性预测值，比较二者检测结果的符合率，对本研究建立的方法的临床应用效果进行考察。
　　 结果：①牛奶过敏原组分的鉴定：在牛奶总蛋白粗提液中观察到约9个主要蛋白条带；鉴定出其中18kd、14kd、28kd、及70kd附近的多个条带出现阳性反应，推测依次为β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、酪蛋白、以及包括牛血清白蛋白在内的多个大分子蛋白组分。②鸡蛋过敏原组分的鉴定：在蛋清总蛋白粗提液中观察到约4个主要蛋白条带，蛋黄总蛋白粗提液中观察到10个主要条带；鉴定出蛋清中分子量大约为78kd、43kd、28kd、14kd的多个条带出现阳性反应，判断为卵清转铁蛋白、卵白蛋白、卵类黏蛋白和溶菌酶；在蛋黄中检测到更多的显色条带，但在实验中出现了明显的非特异显色。③牛奶、蛋清过敏原组分的纯化；通过脱脂、等电点沉淀、凝胶层析、离子交换层析等手段，先后从牛奶中纯化出酪蛋白、大分子蛋白组分(P1)、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白4个过敏原组分，建立了一套完善的纯化工艺；从蛋清中纯化出卵类黏蛋白一个单一组分及数个部分纯化组分。④过敏原的标记及致敏性考察：用辣根过氧化物酶标记了四种牛奶过敏原组分，并通过单一过敏原组分的酶联免疫吸附实验结果发现，双抗原夹心法的阳性率明显高于间接法，而四种过敏原中，β-乳球蛋白和P1组分的阳性率较高。⑤牛奶过敏特异性抗体的双抗原夹心酶免疫检测法的建立及条件优化：根据实验确定配比抗原中各组分的比例为P1：β-乳球蛋白：α-乳白蛋白：酪蛋白=30％：40％：20％：10％，复合酶标抗原中P1、β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、酪蛋白的比例依次为1:1500、1:12000、1:6000和1:6000。最佳包被浓度为50μg/ml，最佳反应时间为1h，最佳血清用量为10μ l。⑥双抗原夹心酶联免疫法检测牛奶特异性抗体的初步临床应用：用本实验建立的双抗原夹心法ELISA检测模式和德国MEDIWISS Analytic GmbH公司的IVTAllergen Screen食物过敏检测试剂盒同时测定一批临床血清，通过比较二者的测定结果得出该方法的灵敏度为91.304％，特异度为94.286％，阳性预测值(PPV)为91％，阴性预测值为94％，同参考方法有较高的符合率。
　　 结论：⑴鉴定出牛奶中的多个过敏原组分，并成功地从牛奶中纯化出4个过敏原组分，摸索出一套完善的牛奶过敏原纯化工艺。⑵鉴定出蛋清中的多种过敏原组分，在鉴定蛋黄中过敏原的实验中发现非特异反应，成功地从蛋清中纯化出一种单一过敏原组分，蛋清过敏原的纯化方法有待进一步改进。⑶对牛奶过敏原进行了辣根过氧化物酶标记，建立了牛奶过敏的双抗原夹心酶免疫检测方法，并确定了试剂的最佳工作浓度和反应条件，通过实验证实其检测性能优于传统的间接法酶免疫检测模式，并在初步临床应用中表现出很高的灵敏度和特异度，同临床应用的进口检测试剂有较高的符合率。