白细胞介素7及其受体通路异常在多发性硬化症自然杀伤细胞中的研究

摘要

目的:最新研究表明编码IL-7Rα的单核苷酸多肽性(single nucleotidepolymorphisms，SNP)rs6897932位点基因型‘C’与多发性硬化症(MultipleSclerosis，MS)易感性相关。研究证实IL-7/IL-7Rα通路对CD4+、CD8+T细胞、调节性T细胞(Regulatory T cells，Treg)的异常调控参与MS疾病的病理发展，但此通路在MS患者自然杀伤细胞(Natural Killer，NK)中的研究尚未见报导。本研究目的在于探索IL-7/IL-7Rα通路在MS患者外周血NK细胞中是否异常及其生物学作用，包括对NK细胞分泌细胞因子的能力、杀伤肿瘤细胞的能力、增殖功能和抗凋亡能力的调节，并探索其可能的作用机制，同时分析该通路与MS病人NK细胞的功能缺陷的相关性，据此提出MS治疗的新思路。
　　方法:收集MS病人和健康对照的外周血，提取血清，用酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测细胞因子IL-2、IL-7、IL-15和IL-21的水平;从MS病人和健康对照的外周血中提取单个核细胞，在体外用人IL-7刺激培养，用流式细胞仪检测NK细胞表面IL-7Rα(CD127)的表达及NK细胞内IFN-γ的分泌水平;用磁珠分离纯化NK细胞，通过检测乳酸脱氢酶的浓度来鉴定其杀伤肿瘤细胞的能力;用溴脱氧尿嘧啶核苷(Bromodeoxyuridine，BrdU)标记增殖的细胞，通过流式细胞术检测NK细胞的增殖;以7-氨基放线菌素D染色（7-amino-actinomycin D staining，7-AAD）和膜联蛋白（AnnexinⅤ）标记调亡或死亡的细胞，检测存活的细胞比例和细胞内抗凋亡因子2-B细胞淋巴瘤（B-cell lymphoma2，Bcl-2）的表达水平。
　　结果:MS病人血清IL-7水平比健康对照显著降低;NK细胞表面表达CD127，MS病人的NK细胞表面CD127的表达水平比健康对照组高;经IL-7刺激后，MS病人和健康对照的NK细胞表达的CD127水平均下降，其中以MS病人的下降幅度明显，在CD3-CD56bright和CD3-CD56dim两个NK细胞亚群都有所体现;CD3-CD56brightNK细胞亚群经IL-7刺激后，MS患者中分泌细胞因子IFN-γ的NK细胞比例增加，同时平均每个NK细胞分泌的IFN-γ量显著增加，CD3-CD56dimNK细胞亚群中此刺激效应不显著;经IL-7刺激后，来自MS病人的NK细胞杀伤K562肿瘤细胞的能力增强，体现在以效应细胞和靶细胞比例为2.5∶1、5∶1、10∶1时，MS病人的NK细胞杀伤肿瘤细胞增多;经IL-7刺激后，CD3-CD56brightBrdU+和CD3-CD56dimBrdU+增殖的NK细胞比例在MS病人和健康对照组中没有显著差别;AnnexinⅤ-7-AAD-标记的存活的细胞比例在MS病人的CD3-CD56brightNK细胞亚群中显著增加，并且抗凋亡因子Bcl-2表达强度在MS病人的CD3-CD56brightNK细胞亚群中显著增强，而CD3-CD56dimNK细胞亚群变化不显著。
　　结论:
　　1、IL-7/IL-7Rα通路在MS病人NK细胞中被异常激活;
　　2、与健康对照相比，IL-7可更大程度上增强MS病人NK细胞分泌细胞因子IFN-γ的能力和杀伤肿瘤细胞的能力，IL-7可以通过上调抗凋亡因子Bcl-2的表达来促进NK细胞的存活;但IL-7对MS病人NK细胞的增殖作用不明显。
　　3、IL-7/IL-7Rα通路对MS病人的NK细胞尤其是CD56bright细胞亚群具有重要的调节作用，推测IL-7/IL-7Rα通路的异常导致了MS病人中NK细胞的功能缺陷，从而进一步促进MS的病理改变。因此靶向针对MS病人NK细胞的IL-7/IL-7Rα通路对MS的治疗具有潜在的价值。

目录

声明

摘要

缩略语／符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、多发性硬化症自然杀伤细胞中白细胞介素7及其受体通路异常

1．1 对象和方法

1．1．1 研究对象

1．1．2 提取血清和定量细胞因子

1．1．3 分离外周血单个核细胞和纯化NK细胞

1．1．4 细胞培养

1．1．5 流式细胞仪分析

1．1．6 细胞杀伤功能实验

1．1．7 溴脱氧尿嘧啶核苷(Bromodeoxyuridine，BrdU)细胞增殖实验

1．1．8 7-氨基放线菌素D染色(7-amino-actinomycin D staining，7-AAD)和膜联蛋白V(Annexin V)细胞凋亡实验

1．1．9 统计分析

1．2 结果

1．2．1 MS病人血清中IL-7水平较正常人低

1．2．2 CD127在MS病人NK细胞上的表达

1．2．3 IL-7体外刺激培养促进MS患者CD56brightNK细胞产生IFN-γ

1．2．4 IL-7体外刺激培养增强MS病人NK细胞的杀伤功能

1．2．5 IL-7体外刺激培养不影响MS病人NK细胞的增殖功能

1．2．6 IL-7体外刺激上调抗凋亡因子Bcl-2从而促进MS病人NK细胞的存活

1．3 讨论

1．3．1 血清IL-7水平和NK细胞表面IL-7Rα的表达

1．3．2 IFN-γ的分泌

1．3．3 杀伤功能

1．3．4 增殖功能

1．3．5 抑制凋亡功能

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述 IL-7／IL-7Rα与自身免疫性疾病

致谢